Σύνθεση και μελέτη φθορισμογόνων υποστρωμάτων με ενδομοριακή απόσβεση φθορισμού κατάλληλων για ευαίσθητο προσδιορισμό ρενίνης

Abstract

The renin-angiotensin system (RAS) plays a central role in the regulation of blood pressure and electrolyte homeostasis. At the first and rate-limiting step of the RAS cascade, renin (EC. 3.4.23.15), a highly specific aspartyl protease, cleaves angiotensinogen, a glycoprotein synthesized in the liver. The product angiotensin I (Ang I) is further converted, by angiotensin converting enzyme (ACE), to angiotensin II (Ang II), which is a potent vasoconstrictor. Excessive secretion of renin can cause hypertension and exacerbate the abnormalities that occur in other diseases, such as congestive heart failure. The development of high putative and specific renin inhibitors can provide an advantageous way of hypertension therapy without side effects. In order to evaluate renin inhibitors and perform automated inhibitor screening, a continuous assay of high sensitivity for measuring renin activity is needed. The development of Intramolecularly Quenched Fluorogenic Substrates (IQFS) suitable for sensitive renin determination was the object of this project. Various methods have been introduced for the quantification of renin activity based on the radioimmunoassay determination of Ang I, fluorogenic or unlabeled substrates. However, these methods are discontinuous and have a low throughput. To overcome this limitation, intramolecularly quenched fluorogenic substrates (IQFS), i.e. substrates bearing a fluorescent marker F and a quencher Q, have been introduced. The IQFS described for renin to date are based on the sequence of angiotensinogen and carry the low-fluorescent EDANS/DABCYL or anthranilic acid/EDDNP as F/Q pairs. Our strategy to obtain IQFS of high sensitivity for measuring renin activity was based on the following considerations: (i) to use the 7-methoxycoumarin/DNP as fluorophore/quencher pair, which is known to combine high fluorescence intensity with good quenching efficiency, (ii) to introduce the 7-methoxycoumarin group via L-Amp, which is compatible with solid phase peptide synthesis methodology and moreover allows the easy variation of its position within the peptide sequence, (iii) to place the DNP quencher either at the N-terminal amino acid, by direct dinitrophenylation, or the side chain of appropriate amino acids, (iv) to search for the shortest possible substrate sequence, which combines good kinetic parameters and quenching efficiency, and (v) to optimise this substrate by systematic variations at individual positions. The design of the substrates was based on the N-terminal tridecapeptide sequence of angiotensinogen, H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-OH, extending from P3? to P10 position. Sixteen IQFS, as well as their fluorescent products liberated upon their hydrolysis catalyzed by renin, have been synthesized by solid phase technique. The synthesis was based on the Fmocmethodology and a trityl-type resin prepared from aminomethyl-polystyrene resin and (RS)-2-chloro- 4?-carboxy-triphenylmethanol handle was used. The N-terminal DNP group was directly incorporated into the resin-bound peptides by our method previously reported. The final deprotected peptides were purified by semi-preparative HPLC and their identification was performed by amino acid analysis and Liquid Chromatography Electrospray Ionisation Mass Spectrometry. ..........................................................

Το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης (RAS) παίζει καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της πίεσης του αίματος και της συγκέντρωσης νερού και αλάτων σε σταθερά επίπεδα. Στο πρώτο και καθοριστικό για την ταχύτητα στάδιο του συστήματος RAS, η ασπαρτυλο-πρωτεάση ρενίνη (EC. 3.4.23.15) υδρολύει το αγγειοτενσινογόνο, μια γλυκοπρωτεΐνη που συντίθεται στο συκώτι. Το προϊόν, η αγγειοτενσίνη Ι, υδρολύεται περαιτέρω από το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης (ACE) και παράγει την αγγειοτενσίνη ΙΙ, η οποία είναι μία από τις ισχυρότερες αγγειοσυσταλτικές ουσίες. Η περίσσεια ρενίνης συνδέεται με παθολογικές καταστάσεις όπως, η υπέρταση και η καρδιακή συμφόρηση. Ο σχεδιασμός κατάλληλων αναστολέων της ρενίνης αναμένεται να οδηγήσει σε αποτελεσματική αντιμετώπιση αυτών των παθολογικών καταστάσεων και αποτελεί πεδίο σημαντικής έρευνας. Η ανάπτυξη μίας ευαίσθητης μεθόδου η οποία να επιτρέπει τον άμεσο και με συνεχή τρόπο προσδιορισμό της δραστικότητας της ρενίνης είναι πολύ σημαντική, καθώς δίνει τη δυνατότητα της αυτόματης αξιολόγησης των αναστολέων και το λεπτομερή κινητικό χαρακτηρισμό τους. Η σύνθεση και η μελέτη συνθετικών φθορισμογόνων υποστρωμάτων με ενδομοριακή απόσβεση φθορισμού (IQFS) κατάλληλων για ευαίσθητο προσδιορισμό ρενίνης ήταν ο σκοπός της παρούσας εργασίας. Πολλές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για τον προσδιορισμό της ρενίνης, βασιζόμενες σε ραδιοανοσοχημικό προσδιορισμό της παραγόμενης αγγειοτενσίνης Ι και σε φθορίζοντα ή μη επισημασμένα υποστρώματα. Αυτές οι μέθοδοι, όμως, έχουν το μειονέκτημα ότι δεν είναι συνεχείς και έτσι δεν επιτρέπουν τον άμεσο προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου. Τη δυνατότητα αυτήν παρέχουν τα IQFS, τα οποία αποτελούνται από μία πεπτιδική αλυσίδα και φέρουν ένα φθορίζοντα δείκτη (F) και μία ομάδα αποσβέστη (Q). Υδρόλυση αυτών των υποστρωμάτων οδηγεί σε ακύρωση της αποσβεστικής ικανότητας και μεταβολή στις φθορισμομετρικές ιδιότητες, επιτρέποντας την άμεση παρακολούθηση της αντίδρασης. Τα αναφερόμενα, μέχρι σήμερα, στη βιβλιογραφία IQFS ρενίνης είναι λίγα και βασίζονται σε συνδυασμό των EDANS/DABCYL και Abz/EDDNP ως ζευγών F/Q. Η στρατηγική που ακολουθήσαμε για τη σύνθεση σε στερεά φάση IQFS υψηλής ευαισθησίας βασίστηκε στα ακόλουθα: α) τη χρησιμοποίηση ως φθορίζουσας ένωσης παραγώγου της 7-μεθοξυ- κουμαρίνης προκειμένου να επιτευχθεί υψηλή ένταση φθορισμού μετά την υδρόλυση, β) τη χρησιμοποίηση ως αποσβέστη της DNP-ομάδας, η οποία είναι γνωστό ότι αποσβένει ικανοποιητικά παράγωγα της 7-μεθοξυ-κουμαρίνης, γ) την εισαγωγή της 7-μεθοξυ-κουμαρυλο-ομάδας στην αλληλουχία των υποστρωμάτων χρησιμοποιώντας το L-Amp, το οποίο, ως α-αμινοξύ, είναι συμβατό με τη μεθοδολογία της σύνθεσης σε στερεά φάση και επιπλέον επιτρέπει την τοποθέτησή του σε οποιαδήποτε θέση της πεπτιδικής αλυσίδας, δ) την εισαγωγή της DNP-ομάδας σε ποικίλες θέσεις και διαφορετικές αποστάσεις από το L-Amp προκειμένου να επιτευχθεί υψηλή απόσβεση φθορισμού. Ο σχεδιασμός των υποστρωμάτων βασίστηκε στην αλληλουχία H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- His-Leu-Val-Ile-His-OH, η οποία αποτελεί τμήμα του αγγειοτενσινογόνου, εκτεινόμενη από την Ρ3΄ έως την Ρ10 θέση. .......................................................