Μελέτη της μορφογένεσης μυκήτων του γένους morchella

Abstract

Initially, the presence as well as the geographical distribution ofthe genus Morchella inGreece were examined and seven species were identified, i.e M. rotunda, M. crassipes,M. vulgaris, M. esculenta, M. conica, M. elata and M. deliciosa. The occurrence of theformer two species is reported for the first time in Greece. From the examination of thegenetic variability of 33 Morchella strains (24 isolated from Greece and 9 from abroad)through the use of molecular-DNA markers (PCR-RAPD technique), the dissociation oftwo distinct morphological species groups was established; the one ofthe adnatae (baseof the hyménium not free) - light coloured species (M esculenta, M. rotunda, M.vulgaris and M. crassipes) and the other of the distantes (base of the hyménium free) -dark coloured species (M. angusticeps, M. elata, M. conica, M. delisioca and M.hortensis).From the study of their eco-physiological characteristics, particularly thoserelated to the presence of ascocarps in their natural habitat in Orestiada area (Evros,northeastern Greece), several plant-hosts of the fungus were detected, i.e. Alnusglutinosa, Ulmus campestris, Robinia pseudacacia, Betula verrucosa, Quercuspubescens e.t.c. In addition, the investigation in native stands revealed that their fruitingis greatly affected by any disturbance ofthe ecosystem, like forest fires or woodcutting.The study of the soil-climatic parameters of the biotope showed that the soil where thefungus thrives are rich in organic matter, have a sand-clay texture, pH : 6.3-6.8 and C/N:13/1-17/1. Furthermore, the analysis oftemperature conditions occurring in the soil andin the outer environment during the formation and emergence of Morchella ascocarpsled at the definition of the temperature limits of ascocarp appearance (soil temperaturegreater than 14 °C and 16 °C for depth 10 cm and 5 cm respectively, along with airtemperature of about 12 °C).Sclerotia formation in nature and the symbiotic association ofMorchella strainswith higher plants were systematically observed at the lower part of ascocarp in situ aswell as by scanning electron microscopy (SEM). Noteworthy was the appearance ofascocarps produced by M. wlgaris and M. rotunda in concentric circles around Robiniapseudoacacia and Alnus glutinosa trees and the emergence ofM. esculenta ascocarps atthe base of young plants of Rubus tomentosus. Additionally, the presence of asubterranean hyphal system that forms a compact aggregate entrapping many soil grains and host roots, as well as the presence of hyphae (forming a spongy-like mycelialpseudo-tissue) engulfing living parts of higher plants, were noted. Observations ofmycelial-soil aggregates by SEM revealed the existence of characteristic ornamentationon hyphae, the presence of mycelial strands and sclerotia in the soil, and confirmed thelateral pattern of their formation. Finally, it was demonstrated that the density of themycelial network, the frequency of vegetative anastomosis among hyphae as well as thesecretion of extracellular binding material increase in conjunction with ascocarpmaturation.In a following research stage, comparative studies were conducted to monitorthe micro- and macro- characteristics of the colonies along with the qualitative andquantitative sclerotia characteristics (maturation degree, arrangement, total number,distribution according to size) of 25 Morchella isolates assigned to eight species (threestrains of ATCC were included). Moreover, the parameters that positively affectedmycelium growth were examined and their optima were determined, i.e. temperature(22-28 °C), relative humidity (34-42%), light (darkness), composition of nutrient media,mainly as regards the carbon (maltose, glucose, starch, sucrose) and nitrogen sources(peptone, ammonium tariate, aspartic acid, urea) as well as the C/N ratio (10/1-32/1).On the contrary, the formation and the morphogenetic evolution of sclerotia werestimulated by temperature fluctuations, with optima ranging among 14-22 °C and 18-26°C for the early and the late fruiting species respectively. The combination of lowtemperatures with the suitable relative humidity (75-85%), darkness, high C/N ratio(32/1-44/1) of substrates and the presence of carbohydrates like sucrose, cellobiose,fructose and inulin gave the best results. In split-plate cultures, it was also noted thatsclerotia morphogenesis is greatly affected from the nutritious base of the colony, theirmaturation depending on the fungal species and the direction that the fungus colonizesthe rich and poor nutritional base. Similar growth and maturation process of sclerotia(but with higher increase of their size) was detected in glass tubes containing both theorganic substrate and the nutrient-poor soil layer.The combination of data originating from in situ observations and the Morchellacolonies growth in vitro contributed in defining the morphogenetic processes involvingM. esculenta hyphae. Furthermore, the rare conidial state (anamorph) Constantinellacristata was detected, its morphological characteristics were studied and for the firsttime factors that affected positively its formation in vitro, i.e. the nutrient medium (WMA with C/N ratio 12/1-15/1), and the environmental parameters (darkness,temperature 10-20 °C and relative humidity 80-90%) were defined. Under the aboveconditions, the formation of the imperfect form was also observed in isolates of M.elata, M. rotunda and M. angusticeps. However, after their continuous cultivation atcommon laboratory media, their conidiophores presented morphological abnormalitiesand ceased to form conidia.Nevertheless, the presence of the Morchella imperfect form was related to theascocarp formation process, which led to assess for the first time the process of theascocarp primordia ontogenesis. During this process, the organs of the imperfect stateform the starting point of mycelial differentiations that progressively lead to thegeneration of primordia pseudo-tissue. This new evidence allowed the study of factors(temperature, relative humidity, lightening, C/N ratio) which regulate their induction invitro. The best results as regards the qualitative and quantitative characteristics ofprimordia were recorded at conditions similar to those that favor also the formation ofthe asexual state. The comparison of eco-physiological data from the natural habitat ofthese fungi and the morphogenetic studies of the in vitro cultures lead to usefulconclusions concerning the conditions that induce morphogenesis ofthe principal stagesofthe life cycle ofMorchella species.

Αρχικά διερευνήθηκε η παρουσία και η γεωγραφική κατανομή των μυκήτων Morchellaστην Ελλάδα και εντοπίσθηκαν επτά είδη, τα Μ. rotunda, Μ. crassipes, Μ. vulgaris, Μ.esculenta, Μ. conica, Μ. elata και Μ. deliciosa. Η παρουσία των δύο πρώτων ειδώναναφέρεται για πρώτη φορά στη χώρα μας. Από τη διερεύνηση της γενετικήςποικιλομορφίας 33 στελεχών Morchella (24 στελέχη που απομονώθηκαν από τηνΕλλάδα και 9 στελέχη αλλοδαπής προέλευσης) με τη χρήση μοριακών-DNA δεικτώνκαι συγκεκριμένα της τεχνικής PCR-RAPD διαπιστώθηκε ότι τα στελέχη μπορούν ναομαδοποιηθούν σε δύο διακριτά σύμπλοκα είδη, αφενός στην ομάδα των συμφυών(βάση υμενίου όχι ελεύθερη)-ανοικτόχρωμων ειδών (Μ. esculenta, Μ. rotunda, Μ.vulgaris και Μ. crassipes) και αφετέρου σε αυτή των απεχόντων (βάση υμενίουελεύθερη)-σκουρόχρωμων ειδών (Μ. angusticeps, Μ. elata, Μ. conica, Μ. deliciosa καιΜ. hortensis).Από την μελέτη των οικο-φυσιολογικών τους χαρακτήρων και τωνπεριβαλλοντικών συνθηκών του φυσικού βιοτόπου της Ορεστιάδας Έβρου, ιδιαίτεραεκείνων που σχετίζονται με την εμφάνιση των ασκοκαρπίων τους, επισημάνθηκανγνωστά και μη φυτά-ξενιστές του μύκητα, όπως το σκλήθρο (Alnus glutinosa), η φτελιά(Ulmus campestri), η ψευδακακία (Robinia pseudacacia), η σημύδα (Betulaverrucosa), η δρυς (Quercus pubescens) κ.α. Επίσης παρατηρήθηκε, ότι ηκαρποφόρησή τους επηρεάζεται σημαντικά από τις διαταράξεις του οικοσυστήματοςόπως από πυρκαγιές ή την υλοτόμηση. Η μελέτη των εδαφο-κλιματικών παραμέτρωντου βιοτόπου έδειξε ότι τα εδάφη όπου ενδημεί ο μύκητας είναι πλούσια σε οργανικήουσία, έχουν σύσταση πηλοαμμώδη, pH 6,3-6.8 και λόγο C/N 13/1-17/1. Ακόμη, ηανάλυση των θερμοκρασιακών συνθηκών που επικρατούν στο εδαφικό καιατμοσφαιρικό περιβάλλον κατά τον σχηματισμό και εμφάνιση των ασκοκαρπίωνMorchella, οδήγησε στον καθορισμό των θερμοκρασιακών ορίων εμφάνισης τωνασκοκαρπίων (θερμοκρασία εδάφους άνω των 14 °C και 16 °C για τα βάθη 10 cm και 5cm αντίστοιχα, μαζί με μέση θερμοκρασία αέρα 12±2 °C).Ο σχηματισμός σκληρωτίων στη φύση και η συμβιωτική σχέση των μυκήτωνMorchella με ανώτερα φυτά εντοπίσθηκε με συστηματικές παρατηρήσεις τουκατώτερου τμήματος των ασκοκαρπίων, τόσο in situ όσο και στο ΗλεκτρονικόΜικροσκόπιο Σάρωσης (ΗΜΣ), στα είδη Μ. esculenta, Μ. vulgaris και Μ. rotunda. Καταγράφηκε η εμφάνιση καρποσωμάτων των μυκήτων Μ. vulgaris και Μ. rotunda σεσχηματισμό ομόκεντρων δακτυλίων γύρω από δένδρα Robinia pseudacacia και Ainusglutinosa αντίστοιχα, καθώς και η εμφάνιση ασκοκαρπίων Μ. esculenta στη βάσηνεαρών φυταρίων Rubus tomentosus. Επιπρόσθετα, διαπιστώθηκε η ύπαρξη υπόγειουμυκηλιακού πλέγματος, που σχηματίζει συμπαγές συσσωμάτωμα με την συνύφανσηπολλών τεμαχιδίων εδάφους μαζί με ρίζες γειτονικών φυτών-ξενιστών, καθώς καιυφικών θηκών από σπογγώδη μυκηλιακό ψευδοϊστό που περιβάλλουν ζωντανάτμήματα ανωτέρων φυτών. Οι παρατηρήσεις των μυκο-εδαφικών συσσωματωμάτωνστο ΗΜΣ έδειξαν την ύπαρξη χαρακτηριστικών επαρμάτων στις υφές, την παρουσίαμυκηλιακών κορδονίων καθώς και σκληρωτίων στο έδαφος και επιβεβαίωσαν τονπλευρικό τύπο σχηματισμού τους. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι η πυκνότητα τουμυκηλιακού πλέγματος, η συχνότητα των βλαστικών αναστομώσεων μεταξύ των υφώνκαθώς και η έκκριση εξωκυτταρικού συγκολλητικού υλικού αυξάνει με την πρόοδοωρίμανσης των ασκοκαρπίων.Σε 25 απομονώσεις Morchella που αντιπροσωπεύουν οκτώ είδη του μύκητα(περιλαμβάνονται και τρία στελέχη της ATCC) έγινε συγκριτική μελέτη των μικρο-καιμακρομορφολογικών χαρακτηριστικών της αποικίας και αξιολογήθηκαν τα ποιοτικάκαι ποσοτικά χαρακτηριστικά των σκληρωτίων (βαθμός ωριμότητας, διάταξη,συνολικός αριθμός, κατά μέγεθος κατανομή). Ακόμη, προσδιορίσθηκαν τιμές τωνπαραγόντων όπως θερμοκρασία (22-28 °C), σχετική υγρασία (95%), εδαφική υγρασία(34-42%), ανάγκες σε φωτισμό (σκοτάδι), σύνθεση του θρεπτικού υποστρώματος,κυρίως ως προς τις πηγές άνθρακα (μαλτόζη, γλυκόζη, άμυλο, σακχαρόζη) και αζώτου(πεπτόνη, τρυγικό αμμώνιο, ασπαραγινικό οξύ, ουρία) και ο λόγος C/N (10/1-32/1), πουευνοούν την ανάπτυξη του μυκηλίου.Αντίθετα, ο σχηματισμός και η μορφογενετική εξέλιξη των σκληρωτίων έδειξαννα επάγονται σε συνθήκες ημερήσιας διακύμανσης της θερμοκρασίας, με άρισταμεταξύ 14-22 °C και 18-26 °C για τα πρώιμα και όψιμα είδη αντίστοιχα. Ο συνδυασμόςχαμηλής θερμοκρασίας με σχετική υγρασία 75-85%, σκοτάδι, υψηλός λόγος C/N (32/1 -44/1) του υποστρώματος και η παρουσία υδατανθράκων όπως σακχαρόζη, κελλοβιόζη,φρουκτόζη και ινουλίνη έδωσαν τα καλύτερα αποτελέσματα. Σε καλλιέργειες εντόςτρυβλίων με διπλά διαμερίσματα, διαπιστώθηκε ακόμη ότι η θρεπτική βάση τηςαποικίας παίζει σημαντικό ρόλο στη μορφογένεση των σκληρωτίων. η ωρίμανση τωνοποίων εξαρτάται από το είδος του μύκητα και την φορά με την οποία αποικίζει τις ζώνες θρέψης και πενίας. Ανάλογη πορεία ανάπτυξης και ωρίμανσης των σκληρωτίων.αλλά σημαντική αύξηση του μεγέθους τους διαπιστώθηκε σε δοκιμαστικούς σωλήνεςπου περιείχαλ’ οργανικό υπόστρωμα και φτωχό εδαφικό μέσο επικάλυψης.Η διασταύρωση των δεδομένων της ανάπτυξης των ειδών Morchella in situ καιαυτών σε in vitro καλλιέργειες συνέβαλλε στην ανίχνευση ορισμένων μορφογενετικώνδιεργασιών στο θαλλό απομονώσεων Μ. esculenta. Συγκεκριμένα επισημάνθηκε ησπάνια εμφανιζόμενη ατελής μορφή Costantinella cristata, μελετήθηκαν ταμορφολογικά της χαρακτηριστικά και προσδιορίσθηκαν, για πρώτη φορά, παράμετροιπου ευνοούν τον σχηματισμό της in vitro, όπως ανάπτυξη των μυκήτων σε φυσικόθρεπτικό υλικό WMA με C/N 12/1-15/1, στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία 10-20 °C καισχετική υγρασία 80-90%. Υπό τις συνθήκες αυτές παρατηρήθηκε σχηματισμός τηςατελούς μορφής και σε στελέχη των ειδών Μ. data, Μ. rotunda και Μ. angusticeps.Ωστόσο διαπιστώθηκε ότι μετά από συνεχείς διαδοχικές καλλιέργειες τωναπομονώσεων αυτών στα συνήθη εργαστηριακά υλικά οι κονιδιοφόροι τουςδιαφοροποιούνται μορφολογικά και στο τέλος παύουν να σχηματίζουν κονίδια.Παρόλα αυτά, η παρουσία της ατελούς μορφής των μυκήτων πουπροαναφέρθηκαν έδειξε να σχετίζεται με την πορεία σχηματισμού των καρποσωμάτωντους, γεγονός που οδήγησε στην καταγραφή και διατύπωση, για πρώτη φορά, μιαςπορείας οντογένεσης των καταβολών των ασκοκαρπίων κατά την οποία τα όργανα τηςατελούς μορφής λειτουργούν ως αφετηρία μυκηλιακών διαφοροποιήσεων πουδρομολογούν το σχηματισμό ψευδοϊστού καταβολών καρποφοριών.Τα πρωτότυπα αυτά ευρήματα επέτρεψαν τη μελέτη και προσδιορισμόπαραγόντων (θερμοκρασία, σχετική υγρασία, φωτισμός, λόγος C/N) που διέπουν τηνεπαγωγή των καρποσωμάτων in vitro. Τα καλύτερα αποτελέσματα στα ποιοτικά καιποσοτικά χαρακτηριστικά των καταβολών καταγράφηκαν σε συνθήκες ανάλογες μεαυτές που ευνοούν και τον σχηματισμό της κονιδιακής μορφής, ήτοι σε λόγο C/N 12/1-15/1, υπό την επίδραση χαμηλών θερμοκρασιών 6-16 °C (άριστο15 °C) και σχετικήυγρασία 75-85%. Η αντιπαραβολή των οικο-φυσιολογικών δεδομένων από τον φυσικόβιότοπο των μυκήτων και των μορφογενετικών μελετών σε in vitro καλλιέργειεςοδήγησε στην εξαγωγή χρήσιμων πορισμάτων όσον αφορά τις συνθήκες που επάγουντη μορφογένεση των διαφόρων σταδίων του βιολογικού κύκλου των μυκήτωνMorchella.