Μελέτη της μοριακής διαταραχής της οικογενούς υπερχοληστερολαιμίας (FH) στον ελληνικό πληθυσμό

Abstract

This study reports the characterization of 63% of low-density lipoprotein receptor (LDLR)gene mutations in 150 unrelated Greek familial hypercholesterolaemia (FH) heterozygouschildren by the analysis of seven LDLR gene mutations. For this purpose, the SSCAtechnique was perfected and applied in order to screen for exons 1-18 of the LDL receptorgene in all the above-mentioned probands.Under strictly specified SSCA electrophoresis conditions, the samples were identified with ashift in their SSCA mobility in exons 2, 4, 6, 9 & 11. Direct sequencing of samples with adistinctive SSCA mobility shift disclosed the presence of seven pathological mutations, five ofwhich had already been identified in other populations and these were C152R in exon 4,S265R and C292X in exon 6, V408M in exon 9 and G528D in exon 11. The mutations S35Pin exon 2 and D280G in exon 6 were identified for the first time in this study.Gene mapping of the LDL receptor gene demonstrated normal fragment sizes in all probandsindicating no major LDLR gene rearrangements. In addition, none of the samples had theApoB Asp3500 to Gin mutation that causes FH.The linkage disequilibrium of two polymorphic rnicrosatellites (DI9S394 and D19S221)flanking the LDLR gene on chromosome 19 to the four most common mutations, stronglysuggests that each mutation is identical-by-descent in the probands included in this study.This is also supported by the geographical distribution of FH families with these mutationsthroughout Greece and permits an estimation of the number of generations from a commonancestor for each mutation.The characterization of 63% of LDLR mutations in a representative sample of Greek FHheterozygotes provides a basis for the diagnosis of FH through DNA analysis in Greece, byusing single-strand conformation polymorphism analysis followed by allele-specificoligonucleotide hybridization (exon 6 mutations) or restriction endonuclease analysis(C152R, V409M) In addition, a rapid diagnostic assay positive for the mutation has beendeveloped for the most common mutation, G528D. The application of simple DNA diagnosticassays for LDLR mutation analysis are appropriate for the early identification of FHheterozygotes in Greece and are useful for the primary prevention of coronary arterydisease.

Αντικείμενο της μελέτης αυτής ήταν ο χαρακτηρισμός της μοριακής διαταραχής τηςΟικογενούς Υπερχοληστερολαιμίας (FH) σε Ελληνικό πληθυσμό. Σε 150 παιδιά με ετερόζυγηFH που παρακολουθούνται μαζί με τις οικογένειες τους από το Λιπιδαιμικό Ιατρείο της Α'Παιδιατρικής Κλινικής, έγινε μοριακός έλεγχος για την ανίχνευση και ταυτοποίησημεταλλάξεων στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον υποδοχέα της χαμηλής πυκνότηταςλιποπρωτεΐνης (LDLR). Τα παιδιά αυτά πληρούν τα αυστηρά κλινικά και βιοχημικά κριτήριαπου επιβάλλει η Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας. Από τον μοριακό έλεγχο των 150 παραπάνωετεροζυγωτών (propositus) και των συγγενών τους προέκυψαν τα παρακάτω αποτελέσματα:Σε κανένα από τα περιστατικά αυτά δεν εντοπίστηκε η πιο κοινή μετάλλαξη (apoB35oo) στοεξόνιο 26 του γονιδίου της Αρο Β100 που προκαλεί οικογενή διαταραχή της Β10ο (FDB). Δενδιαπιστώθηκαν επίσης χρωμοσωμικές αναδιατάξεις στο γονίδιο του LDLR μετά τον έλεγχοπου πραγματοποιήθηκε με χαρτογράφηση του γονιδίου (gene mapping) και τη χρήση τηςμεθόδου Southern. Ο έλεγχος για σημειακές μεταλλάξεις με την ανάλυση της διαμόρφωσηςτης μονόκλωνης δομής του DNA (Single Strand Conformation Analysis, SSCA) στα εξόνια 1έως 18, επέδειξε ασυνήθιστη ηλεκτροφορητική συμπεριφορά σε κάθετη ηλεκτροφόρησηπηκτώματος ακρυλαμιδίου στα 94 από τα 150 δείγματα της μελέτης. Η ανάλυση τωνδειγμάτων αυτών στα αντίστοιχα εξόνια με τη μέθοδο της ανάλυσης της αλληλουχίας τουDNA (sequencing), αποκάλυψε την ύπαρξη 7 παθολογικών μεταλλάξεων. Ο αριθμός αυτόςκαλύπτει το 63% περίπου των περιστατικών (propositus) που μελετήθηκαν. Από τιςμεταλλάξεις αυτές που αποκαλύφθηκαν, οι 5 έχουν ήδη αναφερθεί στην διεθνή βιβλιογραφία,ενώ οι 2 χαρακτηρίσθηκαν για πρώτη φορά μέσα από την εργασία αυτή.Η μελέτη των απλοτύπων για τις τέσσερις συχνότερες μεταλλάξεις (C152R, S265RV408M και Θ528ϋ)με τις οποίες έγινε με τη συσχέτιση τους (σύνδεση) τόσο μεενδογονιδιακούς απλότυπους όσο και με τη μελέτη δύο πολυμορφικών μικροδορυφορικώναλληλουχιών (D19S394 και D19S221), που συνδέονται με το LDLR γονίδιο. Τααποτελέσματα της συσχέτισης αυτής σε συνδυασμό με τη γεωγραφική διασπορά τωνμεταλλάξεων στην Ελλάδα συνηγορούν στην άποψη ότι η κάθε μετάλλαξη προέρχεται απόένα "κοινό πρόγονο" (identical-by-descent) στα παιδιά που μελετήθηκαν. Επί πλέον, με τηχρήση μαθηματικής λογικής προσδιορίστηκε με προσέγγιση η "ηλικία" των τεσσάρων αυτώνμεταλλάξεων λαμβάνοντας υπ' όψιν τον αριθμό των γενεών από τον κοινό πρόγονο, μέχρισήμερα. Ο προσδιορισμός της ηλικίας των πιο συχνών στην Ελλάδα μεταλλάξεωναποκάλυψε τη βραχύβια ιστορία της FH στον Ελληνικό πληθυσμό σε σχέση με άλλα κοινάγενετικά νοσήματα όπως η Μεσογειακή Αναιμία και η Κυστική Ινώδης Νόσος.Η αποκάλυψη ενός σχετικά μικρού αριθμού μεταλλάξεων στο LDLR γονίδιο,υπεύθυνο για το 63% των ασθενών για FH, απέδειξε τη σχετική ομοιογένεια της FH στηνΕλλάδα. Με γνώμονα τη γεωγραφική κατανομή των περιστατικών της FH διαπιστώθηκε ότιορισμένες μεταλλάξεις όπως η G528D (FH-Genoa) και V408M (FH-Afrikaner 2),παρουσίασαν μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης σε ορισμένες περιοχές της Ελλάδας όπωςσε νήσους του Ιονίου, της Δυτικής Στερεάς Ελλάδας, της Κρήτης, και της Πελοποννήσου.