Μοριακή ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γονιδίων σε λεπιδόπτερα έντομα

Abstract

Insect choriogenesis is an ideal system for studying developmentally regulated genes. In the silkworm Bombyx mori the genes that code for chorion proteins are expressed solely in the follicular cells following a temporal-specific pattern involving activation and repression of specific transcription factors. According to their developmental stage of expression, chorion genes are characterized as early, middle and late. The chorion multigene family contains two types of genes, α and β, which are organized in divergently transcribed gene pairs with a common 5’ flanking promoter region. Until now, only middle and late promoter genes have been studied, whereas nothing concerning the specific regulation of early chorion genes has been reported. Their promoter heterogeneity, the existence of unpaired genes and their dispersion in the genome are the major reasons for studying them. This thesis deals with in vitro and in vivo functional study of early chorion gene promoters. Analysis includes identification of cis-regulatory elements and isolation of transcription factors involved in the specific expression of early chorion genes. Further aim is deciphering the mechanisms responsible for the temporal specificity of expression of the examined genes. In vitro functional analysis was performed on the three 6F6 genes (6F6.1, 6F6.2, 6F6.3: unpaired β-type genes), as well the ErA/B.1 gene pair and the unpaired 5H4 gene. For comparative reasons, part of the late HcA/B.13 promoter was also tested. In vitro experiments of DNA-protein interactions revealed a new cis-element, which corresponds to the consensus of the CCAAT / Enhancer Binding Protein (C/EBP) binding site. This sequence interacts with a 65 kDa protein (pX2), named BmCbZ (Bombyx mori Chorion b-ZIP factor). The complex of BmCbZ with early chorion promoters exhibits a characteristic developmental pattern in gel shift assays (EMSA). This pattern is due to the higher concentration of BmCbZ protein in the early compared to the late follicular nuclear extracts. BmCbZ is recognized by polyclonal antibodies against Drosophila melanogaster C/EBP. Morever, these antibodies recognize the putative factor BCFII, which is involved in the activation of late gene expression, suggesting that BmCbZ of early choriogenic stages and BCFII of late stages are either identical or members of the same family of transcription factors. All Bombyx mori chorion gene promoters contain at least one C/EBP site. Given that binding of the BmCbZ factor was observed to a specific C/EBP consensus in each promoter and that two types C/EBP binding sites are present in chorion promoters (one type dominates in the early promoters and the other in the middle and the late ones), it may be argued that BmCbZ binds to the two consensi with different affinity as well as that it interacts with different co-factors during choriogenesis. The transcription factor GATA1 is also involved in regulation of chorion gene expression. GATA binding is observed from the very early stages of choriogenesis and increases towards the late stages. In vitro experiments revealed synergistic and antagonistic interactions between BmCbZ and GATA factors. Antagonism concerns the occupation of specific regions on the promoters. In this study, the construction of a cDNA expression library from vitellogenic and early choriogenic follicular cells led to isolation of the full length BmCbZ cDNA clone. The cDNA clone is 2300 bp and has an open reading frame corresponding to 556 aminoacid residues. The b-ZIP motif in the carboxy-terminal consists of a DNA binding domain (basic region) and a leucine zipper, conferring BmCbZ homo- and hetero-dimerisation properties. The basic region and the leucine zipper are two characteristic domains of the superfamily of b-ZIP transcription factors. The protein coded by the cDNA clone is recognized by the DmC/EBP antibodies and binds to the cis-element of early chorion promoters. .....................

Η χοριογένεση στα έντομα αποτελεί ένα πρότυπο σύστημα για τη μελέτη αναπτυξιακά ρυθμιζόμενων γονιδίων. Στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori τα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες του χορίου εκφράζονται αποκλειστικά στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων, ακολουθώντας ένα αυστηρό πρόγραμμα χρονικής ρύθμισης που περιλαμβάνει ενεργοποίηση και καταστολή γονιδίων ειδικών πρωτεϊνικών παραγόντων στα κύτταρα αυτά. Με βάση τη χρονική περίοδο στην οποία εκφράζονται, τα γονίδια του χορίου διακρίνονται ενδεικτικά σε πρώιμα, ενδιάμεσα και όψιμα. Η πολυγονιδιακή οικογένεια του χορίου αποτελείται από δύο τύπους γονιδίων, α και β, που οργανώνονται σε ζεύγη με αντίθετη κατεύθυνση μεταγραφής και κοινή 5’ ρυθμιστική περιοχή. Μέχρι σήμερα έχουν μελετηθεί υποκινητές ορισμένων ενδιάμεσων και όψιμων γονιδίων, ενώ ελάχιστα είναι γνωστά για τη ρύθμιση της έκφρασης των πρώιμων γονιδίων.. Η ανομοιογένεια των υποκινητών τους, η ύπαρξη αζευγάρωτων γονιδίων καθώς και η θέση τους στο γονιδίωμα είναι οι κύριοι λόγοι για τους οποίους μελετώνται. Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής είναι η in vitro και in vivo λειτουργική μελέτη των υποκινητών των πρώιμων γονιδίων του χορίου. Περιλαμβάνει την εύρεση cis-ρυθμιστικών στοιχείων, την ταυτοποίηση και απομόνωση μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στην προγραμματισμένη έκφραση των πρώιμων χοριογενετικών γονιδίων. Απώτερος στόχος είναι η διαλεύκανση των μηχανισμών που ευθύνονται για τη σωστή χρονοειδική έκφραση των υπό μελέτη γονιδίων του χορίου στο Bombyx mori. Η in vitro λειτουργική μελέτη των υποκινητών πραγματοποιήθηκε στα αντίγραφα του γονιδίου 6F6 (6F6.1, 6F6.2, 6F6.3: αζευγάρωτα, β-τύπου γονίδια), στο ζεύγος γονιδίων ErA/B.1 και στο αζευγάρωτο 5H4, ενώ για λόγους σύγκρισης χρησιμοποιήθηκε τμήμα του υποκινητή του όψιμου ζεύγους γονιδίων HcA/B.13. Πειράματα in vitro αλληλεπίδρασης DNA-πρωτεϊνών οδήγησαν στον εντοπισμό ενός νέου cis-ρυθμιστικού στοιχείου, το οποίο αντιστοιχεί στην αλληλουχία αναγνώρισης των CCAAT / Enhancer Binding Protein (C/EBP) παραγόντων. Το cis-στοιχείο αναγνωρίζεται από μία πρωτεΐνη μοριακού βάρους περίπου 65 kDa (pX2), που ονομάστηκε BmCbZ (Bombyx mori Chorion b-ZIP factor). Το σύμπλοκο του BmCbZ παράγοντα με τους υποκινητές των πρώιμων γονιδίων του χορίου εμφανίζει, σε πειράματα μείωσης της κινητικότητας συμπλόκου DNA-πρωτεϊνών, χαρακτηριστικό πρώιμο αναπτυξιακό πρότυπο. Αυτό εξηγείται από την αυξημένη συγκέντρωσή του στα πρώιμα εν συγκρίσει με τα όψιμα χοριογενετικά στάδια. Ο BmCbZ αναγνωρίζεται από τα αντισώματα έναντι της C/EBP της Drosophila melanogaster. Επίσης, τα αντισώματα αυτά αναγνωρίζουν και τον υποθετικό παράγοντα BCFII, ο οποίος συμμετέχει στην ενεργοποίηση των όψιμων γονιδίων του χορίου, γεγονός που υποδηλώνει είτε την ταύτιση των παραγόντων BmCbZ των πρώιμων σταδίων της χοριογένεσης και BCFII των όψιμων σταδίων είτε την ένταξή τους στην ίδια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων. Αλληλουχίες αναγνώρισης C/EBP υπάρχουν σε όλους του υποκινητές των γονιδίων του χορίου τουλάχιστον μία φορά. Το γεγονός ότι ο BmCbZ παρουσιάζει μεγαλύτερη συγγένεια για συγκεκριμένες αλληλουχίες στον κάθε υποκινητή και εντοπίζονται δύο διαφορετικές αλληλουχίες αναγνώρισης C/EBP στο σύνολο των υποκινητών των γονιδίων του χορίου, με τη μία να κυριαρχεί στα πρώιμα γονίδια και την άλλη στα ενδιάμεσα και όψιμα, υποδηλώνει μεταβολή στη συγγένεια δέσμευσης του BmCbZ καθώς και διαφορετική συνεργασία του με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες κατά τη διάρκεια της χοριογένεσης. Στη ρύθμιση των γονιδίων του χορίου συμμετέχει και ο μεταγραφικός παράγοντας GATA1, ο οποίος προσδένεται στους υποκινητές των πρώιμων γονιδίων από τα πρώιμα στάδια, ενώ η δέσμευσή του αυξάνεται προς τα όψιμα στάδια της χοριογένεσης. .......................