Συσχέτιση μεταλλάξεων του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 και της παρουσίας των ανθρώπειων θηλωματοϊών (HPV) στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας

Abstract

Oral squamous cell carcinoma is one of the ten most frequent cancers of the body, which is more common in men and its frequency increases with age. Human papillomaviruses (HPV) have been implicated in uterine cervical cancer development, however, their role in oral squamous cell carcinoma (OSCC) development is less well defined. The E6 and E7 proteins of HPV are known to bind to the p53 protein and pRB respectively, thus inactivating the tumor suppressor activity of both proteins. The p53 gene has been indicated to be a tumor suppressor gene that is mutated in all human cancers. The aim of this study was to examine the incidence of human papillomavirus infection and p53 alterations in oral squamous cell carcinoma and to investigate a possible correlation between HPV infection and p53 alteration in the development of the disease. For this purpose we examined 60 specimens of primary oral SCCs and 30 cell smears of normal oral mucosa of controls for detection of p53 mutations and HPV DNAs. Exons 5 through 8 of the p53 gene were examined using the PCR-SSCP analysis. Mutations in the p53 gene were observed in 26 out of 60 tumor specimens (43,3%). All mutations were detected in exon 8 while 3 were in found in both exons 7 and 8. P53 mutations were only observed in oral squamous cell carcinomas. Tobacco use and alcohol intake were strongly associated (P<0,01) with the incidence of p53 mutations in the patients of our study. HPV DNA detection was performed using PCR and HPV typing was performed by the use of Southern blot analysis and/or RFLP analysis. HPV DNAs were detected in 27 out of 60 (45%) tumor specimens. High risk HPVs were found in 17 of 27 HPV positive specimens (63%) with predominance of HPV 16. A higher incidence of HPV 16 infection (p<0,01) was observed in oral squamous cell carcinomas than in normal oral mucosas. HPV positivity was not related to age, gender and use of alcohol and or tobacco among the group of patients. Analysis of the results showed no significant correlation between oncogenic HPV infection and p53 gene alterations (p>0,05). Thirty nine out of 60 tumor specimens were found to harbor HPV 16 or 18 DNA or p53 gene mutations. These data suggest that HPV 16 infection and p53 mutations reveal a significant association with oral squamous cell carcinoma. No correlation exists between oncogenic HPV infection and p53 alterations in OSSC. HPV infection was not related to age, gender or use of alcohol and/or smoking. Conversely, we observed a strong association between alcohol and tobacco consumption and mutations of the p53 gene. These findings probably indicate that p53 mutations and HPV 16 contribute independently in the process of oral epithelial carcinogenesis.

Ο καρκίνος της στοματικής κοιλότητας είναι ένας από τους δέκα πιο συχνούς όγκους του σώματος. Οι ανθρώπειοι θηλωματοϊοί (HPV) έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, ωστόσο ο ρόλος τους στην ανάπτυξη του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας δεν έχει διευκρινιστεί επαρκώς. Οι Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεΐνες των υψηλού κινδύνου HPV είναι γνωστό, ότι αλληλεπιδρούν με τις ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες pRB και p53 αντίστοιχα και τις απενεργοποιούν. Το γονίδιο p53 ανευρίσκεται ως το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο στους περισσότερους τύπους καρκίνου, ωστόσο στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, όπου ο ογκογενετικός ρόλος των HPV θεωρείται ως ιδιαίτερα σημαντικός, οι μεταλλάξεις του γονιδίου p53 είναι εξαιρετικά σπάνιες. Βάσει αυτών των δεδομένων σκοπός της μελέτης ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο η παρουσία των ιών HPV συνδέεται με την ανάπτυξη ακανθοκυτταρικού καρκινώματος στη στοματική κοιλότητα, κατά πόσο το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 βρίσκεται συχνά μεταλλαγμένο στο αντίστοιχο καρκίνωμα καθώς επίσης τη διερεύνηση της συσχέτισης της παρουσίας των υψηλού κινδύνου HPV με τις μεταλλάξεις του γονιδίου p53. Για τον σκοπό αυτό διερευνήσαμε 60 ιστικά δείγματα από ακανθοκυτταρικά καρκινώματα της στοματικής κοιλότητας που προήλθαν από ισάριθμους αρρώστους και 30 κυτταρικά επιχρίσματα από υγιή άτομα που αποτέλεσαν την ομάδα αναφοράς. Με την εφαρμογή της μεθόδου PCR-SSCP μεταξύ των εξονίων 5-8 του γονιδίου p53 ανιχνεύτηκαν μεταλλάξεις σε 26 από τα 60 καρκινικά δείγματα (43,3%). Όλες οι μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στο εξόνιο 8, ενώ 3 ήταν κοινές στα εξόνια 7 και 9. Η στατιστική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα αναφοράς ήταν σημαντική (p<0,01). Με τη μέθοδο της PCR 27 δείγματα (45%) αποδείχτηκε, ότι ήταν θετικά για την παρουσία των HPV. Με την περαιτέρω τυποποίηση των ιών με υβριδισμό κατά Southern, καθώς και με τη μέθοδο PCR-RFLP οι υψηλού κινδύνου θηλωματοϊοί ανιχνεύτηκαν σε 17 περιπτώσεις αποτελώντας το 63% των ανιχνευθέντων HPV (17/27) ή το 28% του συνόλου των δειγμάτων (17/60). Ο HPV 16 ήταν ο συχνότερος τύπος ιού που ανιχνεύθηκε (16/17). Η διαφορά στη συχνότητα του γονιδιώματος των HPV μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων ήταν στατιστικά σημαντική (p<0,01). Από την σύγκριση της συχνότητας τόσο των μεταλλάξεων του γονιδίου p53 όσο και της παρουσίας των HPV στα καρκινικά δείγματα προέκυψε, ότι η συχνότητα και των δύο ήταν το ίδιο σημαντική (p<0,01). Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο φαίνεται να συνδέονται με τη συνήθεια του καπνίσματος p=0,05, αλλά πολύ περισσότερο με την ταυτόχρονη λήψη αλκοόλ και χρήση καπνού (p<0,01). Από τα ευρήματά μας προκύπτει, ότι τόσο οι ανθρώπειοι θηλωματοϊοί υψηλού κινδύνου και ιδιαίτερα ο τύπος HPV16, όσο και οι μεταλλάξεις του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 παρουσιάζουν σημαντική συσχέτιση με το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος. Επίσης από την συσχέτιση της παρουσίας των υψηλού κινδύνου ογκογόνων HPV και των μεταλλάξεων του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 προκύπτει, ότι η ανεξάρτητη παρουσία των δύο παραγόντων στα ενδοστοματικά καρκινώματα είναι εξίσου σημαντική. Έτσι η παρουσία των μεταλλάξεων του γονιδίου p53 και η παρουσία των υψηλού κινδύνου HPV που με διαφορετικούς μηχανισμούς αδρανοποιούν τελικά την ογκοκατασταλτική λειτουργία του γονιδίου p53 ανέρχονταν στο 72% του συνόλου των μελετηθέντων ακανθοκυτταρικών καρκινωμάτων.