Ανάλυση των δομικών και λειτουργικών στοιχείων της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 από ποντίκι και διερεύνηση του ρόλου της στην έναρξη του προγράμματος κυτταρικής διαφοροποίησης και απόπτωσης

Abstract

The non-ribosomal functions of mammalian ribosomal proteins have recently attracted worldwide attention. The mouse ribosomal protein S5 (rpS5) derived from ribosomal material is an assembled non phosphorylated protein. The free form of rpS5 protein, however, undergoes phosphorylation. In this study, we have (a) investigated the potential role of phosphorylation in rpS5 protein transport into the nucleus and then into nucleoli and (b) determined which one of the domains of rpS5 are involved in this intracellular trafficking. In vitro PCR-mutagenesis of mouse rpS5 cDNA complemented by subsequent cloning-expression of rpS5 truncated recombinant forms produced in fusion with Green Fluorescent Protein (GFP) permitted the investigation of rpS5 intracellular trafficking in HeLa cells using confocal microscopy complemented by Western blot analysis. Our results indicate the following: (a) rpS5 protein enters the nucleus via the region 38-50 aa that forms a random coil as revealed by Molecular Dynamic Simulation (MDS), (b) Immunoprecipitation of rpS5 with casein kinase II (CKII) and Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) analysis complemented by in vitro kinase assay revealed that phosphorylation of rpS5 seems to be indispensable for its transport from nucleus to nucleoli; upon entering the nucleus, Thr-133 phosphorylation triggers Ser-24 phosphorylation by CKII, thus promoting entrance of rpS5 into the nucleoli. Another important role of rpS5 N-terminal region is proposed to be the regulation of protein’s cellular level. Namely the repetitively co-appearance of a satellite C-terminal band below the entire rpS5 at the late stationary phase and not at the early logarithmic phase of cell growth suggests a specific degradation balancing probably the unassembled ribosomal protein molecules with that which are efficiently assembled to ribosomal subunits. Overall, these data provide new insights on the structural and functional domains within the rpS5 molecule that contribute to its cellular functions. The possible role of rpS5 in cell differentiation was investigated with the siRNA technology or by using MEL cell stable transfected with the recombinant eukaryotic vector pcDNA-3.1-rpS5 (MEL-C14 and MEL-C56 are the isolated clones). For both of the above mentioned clones was shown the rpS5 is implicated in the initiation of cell differentiation program but the mechanism has to be further studied.

H rpS5 ριβοσωμική πρωτεΐνη από ποντίκι είναι φωσφορυλιωμένη στην «ελεύθερη» μορφή της, όταν δεν είναι ενσωματωμένη στο ριβόσωμα (none assembled). Η φωσφορυλίωση της, που διερευνήθηκε in vitro και «in vivo» (ανοσοκατακρήμνιση της πρωτεΐνης με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της κινάση της καζεΐνης ΙΙ ,CKII), έδειξε ότι η CKII φωσφορυλιώνει επιλεκτικά στην αμινοτελική περιοχή τα αμινοξέα Ser-24 και Ser-34. Σύμφωνα με πειράματα μικροσκοπίας συνεστίασης, η ενδοκυτταρική κυκλοφορία της rpS5 από το κυτταρόπλασμα στους πυρήνες γίνεται πιθανόν μέσω της δομικής ευέλικτης περιοχής 38-50aa, η οποία όμως δεν παρουσιάζει ομοιότητα με κάποιο γνωστό στη βιβλιογραφία σήμα εισόδου, NLS). Για την είσοδό της στους πυρηνίσκους πιθανόν «συνεργάζονται» η αμινοτελική και η καρβοξυτελική περιοχή ως εξής: η φωσφορυλίωση της Thr-133 από την PKC πυροδοτεί την φωσφορυλίωση της Ser-24 από την CKII, προάγοντας την μετακίνηση της από τον πυρήνα στους πυρηνίσκους. Η αμινοτελική περιοχή της rpS5, μέσω της PEST περιοχής επάγει εξειδικευμένη πρωτεόλυση των πρώτων 19-20 αμινοξέων, και με αυτόν τον τρόπο, κατά πάσα πιθανότητα, συμβάλλει στην ισορροπία των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (ενσωματωμένων και μη ενσωματωμένων στο ριβόσωμα) στο πυρηνόπλασμα. Ο πιθανός ρόλος της rpS5 στην ερυθροδιαφοροποίηση διερευνήθηκε με αποσιώπηση του γονιδίου της, με την τεχνολογία της RNA παρεμβολής ή με την παρασκευή μόνιμα επιμολυσμένων κλώνων MEL κυττάρων με τον ανασυνδυασμένο ευκαρυωτικό φορέα pcDNA-3.1-rpS5 (MEL-C14 and MEL-C56). Και για τις δύο πιο πάνω περιπτώσεις απορύθμισης της έκφρασης του γονιδίου της rpS5 διαπιστώθηκε ότι η rpS5 εμπλέκεται στην έναρξη του προγράμματος της διαφοροποίησης. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο εμπλέκεται η S5 στην διαφοροποίηση δεν είναι γνωστός και χρειάζεται διερεύνηση.