Εξω-ριβοσωμικές λειτουργίες της S5 ριβοσωμικής πρωτεΐνης από ποντίκι

Abstract

Ribosomal proteins are integral components of the basal cellular machinery involved in protein synthesis, whose roles have been regarded collectively as important, but individually somewhat mundane. However, the last two to three decades, various individual ribosomal proteins from all species, have been found to play roles in regulating cell growth, differentiation, transformation and death, giving rise to increasing speculations that ribosomal proteins can act as multifunctional proteins. The main objective of this thesis encompasses the investigation of the functional role of mouse ribosomal protein S5, (rpS5), in basic cellular functions, such as differentiation and apoptosis. To this respect, several structural elements of rpS5 have been characterized and their possible implication in extra- ribosomal function has been suggested. In particular thesis, the mouse rpS5 was expressed as fusion protein with GST in E.coli, by cloning the corresponding cDNA in the plasmid vector pGEX-2T in order to make its purification easier as well as with GFP by using the vector pEGFP-C1 to facilitate its location intracellurly. It has been found that the recombinant protein is labile within its N-terminal region, the cleavage happening after the first 37aa. Furthermore, by carrying and in vitro phosphorylation assays, it has been found that the phosphorylation of rpS5 taking place by Casein Kinase II, (CKII) is localized within this region of 37aa at N-terminal. Interestingly, bioinformatic analysis of rpS5 primary structure predicted that CKII phosphorylates threonine in position 2, T(2), serine in position 24, S(24) and serine in position 34, S(34), while the target of M38PK kinase, is threonine in position 8, T(8) and threonine in position 14, T(14), is the possible target of an unpredicted kinase. The purification and isolation of mutant forms [at T(2), T(8) and T(14)] of rpS5, in fusion either with GST or GFP, was performed in order to assess in vitro phosphorylation and intracellular localisation, respectively. To this respect, it has been found that the deletion of the first two aa [T(2)] and even the mutant forms T(8) and T(14), did not prevent the in vitro phosphorylation of GST-rpS5 protein by CKII but the phosphorylation seems to be enchanced. Concerning the localization of rpS5 protein within the nucleoli, nucleus and cytoplasm, took place experiments by using confocal microscopy, after deletions of the first 37 aa, (rpS538-204), of the first two aa, (rpS53-204), as well as mutations of T(8) and T(14) to G. The produced truncated or mutated proteins were expressed as fused molecules with GFP, (Green Fluorescent Protein), by using the vector pEGFP-C1. The data obtained has shown that the wild type rpS5 is mainly localised in the nucleolus and to a lesser extent in the cytoplasm. However, the mutant protein rpS538-204 is found diffused inside the nucleus, whereas rpS53-204 and the other two mutants, are mainly localized in the cytoplasm and rarely in the nucleolus. These results suggest that the N-terminal of mouse rpS5 contains structural elements involved in protein localization within the cell, whereas additional work is needed in order to further elucidate their implication in rpS5 structure and function.

Κεντρικό στόχο της συγκεκριμένης διατριβής αποτελεί η διερεύνηση του ρόλου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5, (rpS5), σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η διαφοροποίηση και η απόπτωση, καθώς επίσης και ο χαρακτηρισμός δομικών στοιχείων στο μόριο της πρωτεΐνης, με πιθανή λειτουργική συμμετοχή στη συμπεριφορά του μορίου, ενδοκυτταρικά. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες, αποτελούν αναπόσπαστο μέρος της βασικής κυτταρικής μηχανής, που εμπλέκεται στη πρωτεϊνική βιοσύνθεση, των οποίων ο ρόλος είχε μεν θεωρηθεί σημαντικός, αλλά όχι και τόσο σπουδαίος. Παρόλα αυτά όμως, τις τελευταίες δυο με τρεις δεκαετίες και καλύπτοντας αρκετά είδη, έχουν αναφερθεί ριβοσωμικές πρωτεΐνες που διαδραματίζουν ρόλους στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης, μετασχηματισμού και θανάτου. Όλα αυτά συνηγορούν υπέρ της άποψης, πως οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μπορούν να λειτουργήσουν σαν πολυλειτουργικές πρωτεΐνες. Στη συγκεκριμένη διατριβή, η rpS5 του ποντικού, εκφράστηκε ως χιμαιρικό μόριο με τη GST, ετερόλογα στην E.coli, με τη χρήση του πλασμιδιακού φορέα pGEX-2T, και κατέστη δυνατός ο καθαρισμός της, για περαιτέρω διερεύνηση της βιοχημικής συμπεριφοράς του μορίου, in vitro. Έτσι, προέκυψε πως η rpS5, πρωτεολύεται ειδικά στο N-τελικό της άκρο, και συγκεκριμένα στα 35 πρώτα αμινοξέα. Πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης έδειξαν πως η πρωτεΐνη φωσφορυλιώνεται από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ, (CKII). Η φωσφορυλίωση αφορά στα 37 πρώτα αμινοξέα, όπου είχαν βρεθεί και τρεις πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την CKII, [θρεονίνη στη θέση 2, Τ(2), σερίνη στη θέση 24, S(24) και σερίνη στη θέση 34, S(34)] και δυο από άλλες κινάσες, [θρεονίνη στη θέση 8 και 14, Τ(8) και Τ(14)], με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής. Η απάλειψη της Τ(2), δεν εμπόδισε την in vitro φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης, αντίθετα, την ενίσχυσε. Σε πειράματα ανοσοφθορισμού, όπου η rpS5 εκφραζόταν σε κατάλληλο φορέα ως χιμαιρικό μόριο με την GFP, (Green Fluorescent Protein), μελετήθηκε η υποκυτταρική κατανομή των μεταλλαγμάτων της rpS5, [απάλειψη των 37 πρώτων αμινοξέων, rpS538-204, απάλειψη των δυο πρώτων αμινοξέων, rpS53-204, μετάλλαξη της Τ(8) σε γλυκίνη, (G), και της Τ(14) σε γλυκίνη, (G)], σε σχέση με τη φυσιολογική μορφή της rpS5. Ο ανοσοφθορισμός, με τη βοήθεια μικροσκοπίας συνεστίασης, έδειξε πως η rpS5, (πλήρους αλληλουχίας), εντοπίζεται κυρίως στον πυρηνίσκο και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα, η rpS538-204, βρίσκεται διάχυτη μέσα στον πυρήνα, ενώ η rpS53-204 και τα άλλα δυο μεταλλάγματα εντοπίζονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και σπάνια στους πυρηνίσκους. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν πως η επαγωγή της διαφοροποίησης των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL, με χημικούς επαγωγείς, προκαλεί καταστολή του γονιδίου της rpS5, σε επίπεδο mRNA, ενώ δεν συμβαίνει το ίδιο σε αποπτωτικά κύτταρα. Η ανάπτυξη γενετικά τροποποιημένων κλώνων από MEL κύτταρα, με επιμόλυνση του πλασμιδιακού ευκαρυωτικού φορέα συνεχούς έκφρασης, (pcDNA-3.1), που έφερε ολόκληρη την κωδικοποιούμενη περιοχή του γονιδίου της rpS5, για την υπερέκφραση της πρωτεΐνης, επέτρεψε τη διερεύνηση του ρόλου του γονιδίου και της πρωτεΐνης στο πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων. Έτσι, προέκυψε πως συνεχής έκφραση της ανασυνδυασμένης ριβοσωμικής πρωτεΐνης rpS5, δεν φαίνεται να εμποδίζει το πρόγραμμα διαφοροποίησης να ολοκληρωθεί και ως προς τα δύο υποπρογράμματα, (αυτού που αφορά στον έλεγχο της κυτταρικής αναπαραγωγής, και εκείνου που αφορά στην έκφραση εξειδικευμένων πρωτεϊνικών δεικτών ερυθροδιαφοροποίησης), αλλά προκαλεί μια υστέρηση στην έναρξή του, ανεξάρτητα από τον χημικό επαγωγέα που χρησιμοποιείται. Τέλος, μελέτη των επιπέδων των σημαντικών κινασών του κυτταρικού κύκλου, Cdk2, Cdk4 και Cdk6, έδειξε πως η συνεχής έκφραση της rpS5, στα MEL κύτταρα, φαίνεται να επηρεάζει κυρίως την έκφραση της Cdk2 και Cdk4. Το αποτέλεσμα αυτό, αποτελεί ένα νέο ενδιαφέρον στοιχείο για το σύστημα διαφοροποίησης των κυττάρων MEL, αφού εμπλέκει τη λειτουργία μιας ριβοσωμικής πρωτεΐνης, της rpS5, στη διαδικασία έναρξης της διαφοροποίησης των κυττάρων, με πιθανό αποτέλεσμα την απορύθμιση του κυτταρικού κύκλου.