Μελέτη της μοριακής βάσης της (υποκλινικής) αντοχής στις κινολόνες σε κλινικά στελέχη E. Coli

Abstract

The urinary tract infections are very common in humans and E. coli is the principal causative microorganism. Fluoroquinolones are antibiotics with excellent activity against E. coli. Intensive use of quinolones in the treatment of common infections in humans and animals has led to the spread of resistant microorganisms. One hundred and seventy E. coli strains were collected consecutively (March to December 2000) from UTI outpatients at Laikon teaching hospital and a Center of Primary Health in Athens. Patients admitted to a hospital during the previous month were excluded. Patient data, including demographics, underlying disease, immunological status, hospitalisations, invasive device use, and use of antibiotics during the last 12 months, were also obtained. Species identification was confirmed with the API 20E System (BioMerieux). MICs to nalidixic acid and ciprofloxacin were determined by the E-test method (AB Biodisk). Susceptibility to other antimicrobials was determined by the disk diffusion method. PCR amplification of the quinolone resistance determining regions (QRDRs) of the gyrA and parC genes was performed as described previously. Amplicons were purified with a QiaQuick spin PCR purification kit and the nucleotide sequences were determined using an automatic sequencer (ABI Prisma, Applied Biosystems). Associations between QREC isolation and various patient characteristics were assessed by contingency tables and chi-square tests with continuity corrections. Relative risks were estimated by calculating odds ratios and their corresponding 95% confidence intervals through backward multiple logistic regression analysis using Stata 6 software (Stata Corp., College Station, TX, USA). Resistance to nalidixic acid was observed in 25 (14.7%) isolates, 15 (60%) of which were also resistant to ciprofloxacin. An association of resistance to quinolones with resistance to other antibiotics was evident as in the whole sample described above. Mutations in the QRDR of the gyrA gene were detected in all 25 isolates. Additional mutations in the QRDR of the parC gene were found in 15 of the QREC isolates. The most frequent mutations were those leading to the following substitutions: Leu for Ser-83 of gyrA (22 isolates), Asn for Asp-87 of gyrA (15 isolates), and lie for Ser-80 of parC (14 isolates). High-level resistance to ciprofloxacin was associated with mutations at both 83 and 87 codons of the gyrA gene and one or two additional mutations in parC (codons 80 and 84). Univariate analysis showed that isolation of QREC strains was positively associated with age. Older (>65 years) UTI patients were at increased risk of being infected by a QREC than a quinolone-susceptible strain as compared with younger patients (P = 0.01). Isolation of QREC strains was also related strongly with the presence of underlying chronic diseases (P < 0.001), complicated UTIs (P = 0.005), previous UTI episodes (P < 0.001), and recent exposure to quinolones (P < 0.001). Associations of QREC isolation with gender, and use of non-quinolone antibiotics were not statistically significant. Multivariate logistic regression analysis indicated that, only chronic disease (odds ratio [OR] 22.3, 95% confidence interval [Cl] 3-128, P = 0.03) and use of fluoroquinolones (OR 80.7, CI 11-613, P < 0.001) acted as independent risk factors for infection by a strain in this population. Resistance was the result of quinolones use, because all but two patients had used quinolones during the last 12 months. Chronic disease, which acted as the second independent risk factor, probably reflects the use of antibiotics before the beginning of this study. And the multiple resistance of QREC strains reflects the need of antibiotic use by patients with chronic diseases. The use of quinolones causes the first mutation and when quinolones are used again, second step mutations develop high-level resistance. As result of this study quinolone resistance is increasing in our country. They are very effective drugs against UTIs. But we must control the use of these antibiotics in order to reduce the development of such resistance.

Οι λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος είναι από τις συχνότερες λοιμώξεις του ανθρώπου και ο συνηθέστερος μικροοργανισμός που τις προκαλεί είναι η E. coli. Οι φθοριοκινολόνες είναι μια σημαντική κατηγορία αντιβιοτικών με εξαιρετική δραστικότητα έναντι της E. coli. Με την ευρεία, όμως, χρήση των κινολονών τα τελευταία χρόνια παρατηρείται υψηλή συχνότητα απομόνωσης στελεχών E. coli ανθεκτικών στις κινολόνες (QREC). Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν να μελετηθεί η συχνότητα απομόνωσης κλινικών στελεχών E. coli από εξωνοσοκομειακές ουρολοιμώξεις, που παρουσίαζαν μειωμένη ευαισθησία ή πλήρη αντοχή στις κινολόνες, να διευκρινιστούν οι αντίστοιχοι μηχανισμοί αυτής της αντοχής και να εκτιμηθούν οι παράγοντες κινδύνου λοίμωξης με στελέχη E. coli ανθεκτικά στις κινολόνες. Το υλικό της διατριβής αποτέλεσαν 170 κλινικά στελέχη E. coli, που απομονώθηκαν από καλλιέργειες ούρων εξωνοσοκομειακών ασθενών από τα Εξωτερικά Ιατρεία και τις Κλινικές του Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Λαϊκό» και ενός Κέντρου Πρωτοβάθμιας Περίθαλψης σε χρονικό διάστημα 11 μηνών. Ο έλεγχος της ευαισθησίας σε 16 αντιβιοτικά έγινε με την μέθοδο διάχυσης των δίσκων (Kirby Bauer) με βάση τις οδηγίες της NCCLS. Ο έλεγχος της MIC όλων των κλινικών στελεχών E. coli σε 4 αντιβιοτικά (ναλιδιξικό οξύ, σιπροφλοξασίνη, τετρακυκλίνες, χλωραμφαινικόλη) έγινε με την μέθοδο E-test. Ακολούθησε ο πολλαπλασιασμός των QRDRs (quinolone resistance determing regions) των gyrA και parC γονιδίων των κλινικών στελεχών E. coli με τεχνική PCR. Καθορίστηκαν οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες τους με έναν αυτόματο αναλυτή καθορισμού νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencer) και συγκρίθηκαν με τις υπάρχουσες δημοσιευμένες στο GeneBank μέσω του προγράμματος Blastn. Η συσχέτιση των ανθεκτικών στελεχών E. coli με τα επιδημιολογικά στοιχεία των ασθενών έγινε με την χρήση του x². Η πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το μοντέλο πολλαπλής λογαριθμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας το στατιστικό πρόγραμμα STATA 6 (STATA Corp.). Από τα 170 στελέχη βρέθηκαν 25 ανθεκτικά στο ναλιδιξικό οξύ, ποσοστό 14.7%. Τα 15 από αυτά (60% των QREC και 8,8% του συνόλου των εξωνοσοκομειακών λοιμώξεων) ήταν, επίσης, ανθεκτικά στην σιπροφλοξασίνη. Τα QREC παρουσίαζαν σημαντικά ποσοστά αντοχής και σε άλλα αντιβιοτικά. Όλα τα 25 QREC στελέχη έφεραν μεταλλαγές στην QRDR gyrA, ενώ σε 15 από αυτά βρέθηκαν μεταλλαγές και στην QRDR της parC. Οι πιο συχνές μεταλλαγές ήταν η υποκατάσταση της σερίνης (Ser)-83 από λευκίνη (Leu) στην gyrA (22 στελέχη), του ασπαρτικού οξέος (Asp)-87 από ασπαραγίνη (Asn) στην gyrA (15 στελέχη) και της σερίνης (Ser)-80 από ισολευκίνη (Ile) στην parC (14 στελέχη). Η υψηλού βαθμού αντοχή στην σιπροφλοξασίνη σχετίζονταν με μεταλλαγές και στα δύο κωδικόνια 83 και 87 του γονιδίου της gyrA και μία ή δύο επιπλέον μεταλλαγές στα κωδικόνια 80 και 84 της parC. Τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν απόλυτα με αναφορές από τη διεθνή βιβλιογραφία. Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η απομόνωση QREC στελεχών είχε θετική συσχέτιση με την ηλικία (>65 ετών), την παρουσία χρόνιας νόσου, επιπλεγμένης ουρολοίμωξης, προηγούμενων επεισοδίων ουρολοίμωξης και πρόσφατης χρήσης κινολονών. Η πολλαπλή λογαριθμική ανάλυση απέδειξε ότι μόνο η χρόνια νόσος και η χρήση φθορισμένων κινολονών αποτελούσαν ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου για λοίμωξη με QREC στέλεχος. Ο συνδυασμός των παραπάνω πληροφοριών έδειξε ότι υπάρχει σημαντικό ποσοστό αντοχής στις κινολόνες σε κλινικά στελέχη E. coli από εξωνοσοκομειακές ουρολοιμώξεις στην Ελλάδα. Συγκεκριμένα υπάρχουν δύο υποπληθυσμοί, ο ένας με μονήρεις μεταλλαγές στην gyrA, που προκαλούν υποκλινική αντοχή, και ο άλλος με δύο μεταλλαγές στην gyrA και μία ή δύο μεταλλαγές στην parC, που συνοδεύεται από μεγάλου βαθμού αντοχή στις κινολόνες, ενώ δεν αποκλείεται η ταυτόχρονη παρουσία και άλλων μηχανισμών αντοχής. Επομένως, η ανίχνευση της παρουσίας του υποπληθυσμού που παρουσιάζει την υποκλινική αντοχή στις κινολόνες έχει σημασία στην εκτίμηση του κινδύνου εξάπλωσης QRECs. Είναι πολύ πιθανό τα κλινικά στελέχη να ανέπτυξαν αντοχή ως αποτέλεσμα πίεσης επιλογής κατά τη διάρκεια θεραπείας με κινολόνες, δεδομένου ότι όλα εκτός από δύο προέρχονταν από ασθενείς που ανέφεραν λήψη κινολονών τον τελευταίο χρόνο. Η χρόνια νόσος, που αποτελούσε τον δεύτερο ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου, ίσως αποτελεί έναν δείκτη κατανάλωσης αντιβιοτικών, και ενδεχομένως κινολονών, πριν από την χρονική περίοδο που κάλυπτε η παρούσα μελέτη. Παράλληλα, η πολλαπλή αντοχή που παρουσιάζουν τα περισσότερα QREC στελέχη, έχει παρατηρηθεί και από άλλους ερευνητές και ίσως αντανακλά την συχνή ανάγκη κατανάλωσης αντιβιοτικών από τους χρόνιους πάσχοντες. Τα συμπεράσματα της διατριβής δείχνουν την αυξανόμενη συχνότητα της μικροβιακής αντοχής στις κινολόνες στη χώρα μας και πρέπει να γίνεται με αυστηρά κριτήρια η χρήση τους, ώστε να περιοριστεί ο ρυθμός ανάπτυξης αυτής της αντοχής.