ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΡΙΩΝ ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΩΝ ΑΠΟ ΠΥΡΗΝΕΣ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΚΟΥΝΕΛΙΟΥ

Abstract

THE PURIFICATION AND PROPERTIES OF THREE RIBONUCLEASES FROM RABBIT BRAIN NUCLEIIS REPORTED IN THE PRESENT THESIS. THE ENZYMES, CALLED RIBONUCLEASES A1, A2 AND B RESPECTIVELY ARE EXTRACTED FROM NUCLEI BY MEANS OF 0.5 M NACL AND PURIFIED BY A SERIES OF ION EXCHANGE AND AFFINITY CHROMATOGRAPHY STEPS. THE RIBONUCLEASES DISPLAY OPTIMAL ACTIVITY AT NEAR NEUTRAL PH IN THE PRESENCE OF 50-80 MM NACL AND DO NOT REQUIRE BIVALENT IONS. THEY ARE ENDONUCLEASES AND THEIR HYDROLYSIS PRODUCTS BEAR A FREE 5' HYDROXYL GROUP, WHILE THE TERMINAL PHOSPHATE IN ENZYMES A1 AND A2 IS MONOESTERIFIED AT THE 3' POSITION AND IN ENZYME B IS DIESTERIFIED AT POSITIONS 2' AND 3'. IN ORDER TO ESTABLISH THEIR BASE SPECIFICITY, THE ENZYMES HAVE BEEN ALLOWED TO ACT ON DIFFERENT SUBSTRATES SUCH AS DINUCLEOSIDE MONOPHOSPHATES, DEPHOSPHORYLATED TRINUCLEOTIDES, HOMOPOLYRIBONUCLEOTIDES AND 5 S RNA FROM E. COLI. RNASE A1 CLEAVES PREFERENTIALLY APN BONDS, RNASE A2 WAS FOUND TO BE PYRIMIDINE SPECIFIC IN THAT IT PREFERENTIALLY CLEAVES YPN BONDS, AND RNASE BHYDROLYZES RPU BONDS. FURTHERMORE THE THREE ENZYMES POSSESS DIFFERENT IMMUNOLOGICAL PROPERTIES, SINCE ANTIBODIES RAISED AGAINST RNASE B DO NOT CROSSREACT WITH THE OTHER TWO RIBONUCLEASES.

ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΥΤΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΑΝ ΤΡΕΙΣ ΝΕΕΣ ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΑΠΟ ΠΥΡΗΝΕΣ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΚΟΥΝΕΛΙΟΥ, ΠΟΥ ΟΝΟΜΑΣΤΗΚΑΝ Α1, Α2 ΚΑΙ Β. ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΕΚΧΥΛΙΣΤΗΚΑΝ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΠΥΡΗΝΕΣ ΜΕ 0.5 Μ ΝΑCL, ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΤΗΚΑΝ ΜΕ ΜΙΑ ΣΕΙΡΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΑ ΣΤΑΔΙΑ ΙΟΝΙΚΗΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΚΑΙ ΑΓΧΙΣΤΕΙΑΣ. ΔΡΟΥΝ ΚΑΛΥΤΕΡΑ ΚΟΝΤΑ ΣΤΗΝ ΟΥΔΕΤΕΡΗ ΠΕΡΙΟΧΗ ΤΟΥ ΡΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑ 50-80 ΜΜ ΝΑCL, ΚΑΙ ΔΕΝ ΑΠΑΙΤΟΥΝ ΔΙΣΘΕΝΗ ΙΟΝΤΑ. ΕΙΝΑΙ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ, ΚΑΙ ΤΑ ΠΡΟΙΟΝΤΑ ΥΔΡΟΛΥΣΗΣ ΕΧΟΥΝ ΕΛΕΥΘΕΡΟ 5' ΥΔΡΟΞΥΛΙΟ, ΕΝΩ Η ΑΚΡΑΙΑ ΦΩΣΦΟΡΙΚΗ ΟΜΑΔΑ ΣΤΑ ΜΕΝ ΕΝΖΥΜΑ Α1 ΚΑΙ Α2 ΕΙΝΑΙ ΜΟΝΟΕΣΤΕΡΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΣΤΗΝ 3' ΘΕΣΗ, ΣΤΗ ΔΕ ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ Β ΕΙΝΑΙ ΚΥΚΛΙΚΑ ΔΙΕΣΤΕΡΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΣΤΙΣ 2' ΚΑΙ 3' ΘΕΣΕΙΣ. ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΙΣ ΒΑΣΕΙΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΟΠΩΣ ΑΠΟΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΜΕΝΑ ΔΙ- ΚΑΙ ΤΡΙΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ,ΟΜΟΠΟΛΥΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ ΚΑΙ 5 S RNA ΑΠΟ E. COLI. ΒΡΕΘΗΚΕ ΟΤΙ Η ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ Α1 ΥΔΡΟΛΥΕΙ ΔΕΣΜΟΥΣ ΑΡΝ, Η ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ Α2 ΕΙΝΑΙ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗ ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΕ ΠΥΡΙΜΙΔΙΝΕΣ, ΚΑΙ ΥΔΡΟΛΥΕΙ ΔΕΣΜΟΥΣ ΥΡΝ, ΕΝΩ Η ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ Β ΥΔΡΟΛΥΕΙ ΔΕΣΜΟΥΣ RPU. ΤΑ ΤΡΙΑ ΕΝΖΥΜΑ ΕΧΟΥΝ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ, ΚΑΘΩΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑ ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΗ ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ Β ΔΕΝ ΑΝΤΙΔΡΑ ΜΕ ΤΙΣ ΑΛΛΕΣ ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ.