Ο ρόλος του οξειδωτικού stress στην έναρξη της αθηρωμάτωσης. Αλληλεπιδράσεις μονοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια εξωκυττάριας ουσίας

Abstract

The interactions between monocytes and endothelial cells with the extracellular matrix play a key role at the early stages of atheromatosis, while oxidative stress is considered to be one of the main factors that contribute to the formation of the atheromatic lesion. In the present dissertation the effect of oxidative stress in the interactions between monocytes and endothelial cells with extracellular matrix molecules was studied in the scope of a general effort to understand the complex mechanism of atheromatosis. According to the results, monocytes derived from patients with diabetes mellitus type II carbonylated laminin-1 at a higher degree, while they also produced increased levels of reactive oxygen species (ROS) as compared to those from healthy volunteers, indicating that laminin carbonylation is possibly mediated by ROS. For the investigation of the biological role of carbonylation in the induction of atheromatosis, monocyte attachment and migration through basement membrane proteins, functions that are associated with the pathogenesis of the disease, were then studied. Our results indicated a modified interaction between monocytes and the basement membranes in diabetes mellitus. Specifically, our results showed that monocytes from type II diabetics attached at a higher degree to laminin-1 and collagen IV as compared to controls, which they attached at a higher degree to the oxidized forms of the above proteins as compared to the non-oxidized molecules. Attachment to laminin seemed to be mediated by the alpha2, alphaL and beta2 integrin subunits, which were found to be elevated in monocytes from type II diabetics. Furthermore, control monocytes migrated at a higher degree through nonoxidized laminin in relation to the oxidized molecule and as compared to monocytes from type II diabetics. Moreover, they migrated more through non-oxidized collagen IV in relation to the oxidized molecule and at a lower degree as compared to monocytes from type II diabetics. The results of the present study indicate that laminin oxidation affects the interactions between monocytes and endothelial cells. Our results showed that monocytes attached at a higher degree to the endothelial cells that were pre-attached to oxidized laminin as compared to those pre-attached to the non-oxidized molecule, with the involvement of the alphaΜ and beta2 integrin subunits. Moreover, the endothelial cells attached to oxidized laminin expressed higher levels of the adhesion molecule ICAM-1 as compared to those that were attached to the non-oxidized molecule. Based on the above, it seems that the endothelial cells after their attachment to oxidized laminin are activated, leading to increased ICAM-1 expression and subsequently inducing monocyte attachment through the integrin aΜb2. One of the main targets of the present study was to contribute to the enrichment of knowledge considered the mechanisms adopted from monocytes in response to high concentrations of either glucose or insulin. The induction of signaling pathways with the combined involvement of the signaling molecules PKC, ROS, NADPH oxidase, PI3K, Ca2+ and NHE-1 in monocytes exposed to either glucose or insulin are documented for the first time. According to our results, glucose and insulin increased O2 - and H2O2 production as well as monocyte induced laminin-1 and collagen IV carbonylation. In conclusion, the results of the present dissertation indicate the key role of oxidative stress and of some signaling molecules in events associated with the pathogenesis of atheromatosis. The oxidation of ECM proteins, the expression of adhesion molecules, as well as the involvement of several signaling molecules in the mechanisms studied contribute to a more complete understanding of the pathogenesis of atheromatosis.

Οι αλληλεπιδράσεις των μονοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια της εξωκυττάριας ουσίας διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στα πρώτα στάδια της αθηρωμάτωσης, ενώ το οξειδωτικό stress θεωρείται σήμερα ένας από τους κύριους παράγοντες σχηματισμού της αθηρωματικής πλάκας. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η επίδραση του οξειδωτικού stress στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μονοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια της εξωκυττάριας ουσίας στα πλαίσια μιας γενικότερης προσπάθειας κατανόησης του πολύπλοκου μηχανισμού της αθηρωμάτωσης. Σύμφωνα με τα εξαγόμενα αποτελέσματα τα μονοκύτταρα που προήλθαν από ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ καρβονυλίωσαν περισσότερο τη λαμινίνη- 1 και παρήγαν αυξημένα ποσά δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) σε σχέση με τα μονοκύτταρα των υγιών δοτών, υποδεικνύοντας ότι πιθανότατα η καρβονυλίωση της λαμινίνης γίνεται μέσω ROS. Στα πλαίσια διερεύνησης του βιολογικού ρόλου της καρβονυλίωσης στην πρόκληση της αθηρωμάτωσης μελετήθηκε στη συνέχεια η προσκόλληση και η μετανάστευση μονοκυττάρων σε πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών, ιδιότητες που σχετίζονται με την παθογένεια της ασθένειας. Τα αποτελέσματά μας υπέδειξαν μια τροποποιημένη αλληλεπίδραση ανάμεσα στα μονοκύτταρα και τις βασικές μεμβράνες στο σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ. Πιο συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι τα τύπου ΙΙ μονοκύτταρα των διαβητικών τύπου ΙΙ προσκολλήθηκαν περισσότερο στη λαμινίνη-1 και το κολλαγόνο IV σε σχέση με τα φυσιολογικά, τα οποία με τη σειρά τους προσκολλήθηκαν περισσότερο στις οξειδωμένες μορφές των παραπάνω πρωτεϊνών σε σχέση με τα μη οξειδωμένα μόρια. Τα γεγονότα προσκόλλησης στη λαμινίνη φάνηκε να μεσολαβούνται από τις alpha2, alphaL και beta2 υπομονάδες της ιντεγκρίνης οι οποίες βρέθηκε να είναι αυξημένες στα μονοκύτταρα των διαβητικών ασθενών τύπου ΙΙ. Παράλληλα βρέθηκε ότι τα μονοκύτταρα των υγιών ατόμων μετανάστευσαν περισσότερο διαμέσου της μη οξειδωμένης λαμινίνης σε σχέση με το οξειδωμένο μόριο και σε σχέση με τα μονοκύτταρα των διαβητικών. Επίσης μετανάστευσαν περισσότερο διαμέσου του μη οξειδωμένου κολλαγόνου IV σε σχέση με το οξειδωμένο μόριο και λιγότερο σε σχέση με τα μονοκύτταρα των διαβητικών τύπου ΙΙ. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν επίσης ότι η οξείδωση της λαμινίνης επηρεάζει και τις αλληλεπιδράσεις των μονοκυττάρων με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Βρέθηκε λοιπόν ότι τα μονοκύτταρα προσκολλήθηκαν περισσότερο στα ενδοθηλιακά κύτταρα που είχαν προσκολληθεί στην οξειδωμένη λαμινίνη σε σχέση με αυτά που προσκολλήθηκαν στο μη οξειδωμένο μόριο με τη συμμετοχή των alphaΜ και beta2 υπομονάδων της ιντεγκρίνης. Επίσης, τα ενδοθηλιακά κύτταρα που προσκολλήθηκαν σε οξειδωμένη λαμινίνη εκφράσανε αυξημένα επίπεδα του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 σε σχέση με αυτά που προσκολλήθηκαν στο μη οξειδωμένο μόριο. Με βάση τα παραπάνω φαίνεται ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα μετά την προσκόλλησή τους στην οξειδωμένη λαμινίνη ενεργοποιούνται, οδηγώντας σε αυξημένη έκφραση του ICAM-1 και επάγοντας ακολούθως την προσκόλληση των μονοκυττάρων μέσω της αΜβ2 ιντεγκρίνης. Ένας από τους κύριους στόχους της παρούσας μελέτης είναι να συμβάλλει στον εμπλουτισμό της γνώσης των μηχανισμών που υιοθετούν τα μονοκύτταρα, ως απόκριση στην επίδραση υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης ή ινσουλίνης. Η επαγωγή οδών μετάδοσης σήματος, με τη συνδυασμένη συμμετοχή των σηματοδοτικών μορίων PKC, ROS, NADPH οξειδάση, PI3K, Ca2+ και NHE-1 σε μονοκύτταρα που εκτίθενται γλυκόζη ή ινσουλίνη, αναφέρεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τόσο η γλυκόζη όσο και η ινσουλίνη αύξησαν την παραγωγή O2 - και H2O2 καθώς και την επαγόμενη από τα μονοκύτταρα καρβονυλίωση της λαμινίνης-1 και του κολλαγόνου IV. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υποδεικνύουν τον κεντρικό ρόλο που κατέχει το οξειδωτικό stress και ορισμένα σηματοδοτικά μόρια σε γεγονότα που σχετίζονται με την παθογένεια της αθηρωμάτωσης. Η οξείδωση των πρωτεϊνών της ECM, η έκφραση μορίων προσκόλλησης καθώς και η συμμετοχή ορισμένων σηματοδοτικών μορίων στους μηχανισμούς που μελετήθηκαν, συμβάλλουν στην πληρέστερη κατανόηση της παθογένειας της αθηρωμάτωσης.