Παραγωγή κυτταροτοξικών κυττάρων γενετικά τροποποιημένων ώστε να αναγνωρίζουν την HER-2/neu ογκοπρωτεΐνη, μέσω χιμαιρικών υποδοχέων: Πειραματικά μοντέλα θεραπείας HER-2/neu θετικών χειρουργημένων όγκων

Abstract

The HER-2/neu proto-oncogene is overexpressed in a variety of human cancers and this is correlated with increased malignancy and poor prognosis. HER-2/neu is an immunogenic protein because it contains epitopes which are recognized by T cells in a MHC class I and class II restricted fashion. However vaccination with most of these peptide-epitopes has met limited success mostly due to the fact that HER-2/neu is a self protein and as such is subjected to tolerance mechanisms which hamper the capacity of HER-2/neu high affinity T cell clones to develop effective HER-2/neu specific antitumor immunity. Another drawback for using peptides for vaccination studies is that these are limited only to patients expressing the appropriate MHC class I and class II alleles. To circumvent this problem, NK cells have been generated with a grafted MHC-independent recognition specificity for HER-2/neu expressing tumor cells. In contrast with T cells, NK cells don’t need a pre-sensitization to kill their target cells. NK cells can kill cancer cells in a MHC independent fashion, by cytokine production and tumor cell lysis. In addition NK cells are much more cytotoxic than T cells. However, T cells are used in the most immunotherapy protocols, because it is possible activated NK cells to be cytotoxic against healthy self cells or allergenic cells. Besides activated NK cells have such a low growth rate that it is difficult to be used in an immunotherapy protocol. To circumvent this problem, instead of NK cells, cells of NK92 cell line are used in immunotherapy protocols. In the present study, NK92 cells, transduced to express the scFv from a human anti-HER-2/neu monoclonal antibody fused to the ζ signaling domain of CD3, specifically lyse in vitro and in vivo HER-2/neu positive tumors. NK92 trunsduced cells directly mediated HER-2/neu targeted lysis of HER-2/neu expressing tumor cell lines, through a cell to cell contact. More importantly, NK92 genetically engineered cells mediated additional antitumor effects via secretion of the scFv domain of their chimeric receptor. The soluble scFv has a cytostatic activity against positive and dependant HER-2/neu cell lines (SKBR3). So, the NK92 transduced cells have a double mode of action against positive and dependant HER-2/neu cancer cells cancel.

Η HER-2/neu ογκοπρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε πολλά είδη καρκίνου στον άνθρωπο. Έχει αποδειχθεί ότι αυτό σχετίζεται με αυξημένη μεταστατική ικανότητα και μειωμένη πρόγνωση. Επιπρόσθετα, η HER-2/neu είναι μια ανοσογονική πρωτεΐνη, διότι διαθέτει επιτόπους, οι οποίοι με τη βοήθεια των αντιγόνων ιστοσυμβατότητας της τάξης I και II (MHC class I, II ), αναγνωρίζονται από τα Τ λεμφοκύτταρα. Δυστυχώς παρατηρείται μεγάλη δυσκολία στη σύνθεση ενός αποτελεσματικού εμβολίου, διότι πρόκειται για εαυτό αντιγόνο, με αποτέλεσμα να αναπτύσσεται μηχανισμός αυτοανοχής (self tolerance) και κατ' επέκταση απουσία απόκρισης των Τ λεμφοκυττάρων. Προκειμένου να αντιμετωπιστούν τα προβλήματα αυτά, δημιουργήθηκαν, στα πλαίσια της εργασίας αυτής, γενετικά τροποποιημένα ΝΚ κύτταρα, τα οποία αναγνωρίζουν ειδικά καρκινικά κύτταρα, θετικά για HER-2/neu. Τα ΝΚ κύτταρα, σε αντίθεση με τα Τ λεμφοκύτταρα, δε χρειάζονται προευαισθητοποίηση, προκειμένου να εκδηλώσουν την κυτταροτοξική τους δράση. Καταστρέφουν αυτόματα τους στόχους τους, αποτελώντας την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού. Επιπλέον, τα ενεργοποιημένα ΝΚ κύτταρα επιδεικνύουν σαφώς μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα εναντίον καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με τα Τ κύτταρα. Παρόλα αυτά, στα περισσότερα πρωτόκολλα ανοσοθεραπείας του καρκίνου χρησιμοποιούνται τα Τ λεμφοκύτταρα, διότι τα ενεργοποιημένα ΝΚ είναι πιθανόν να παρουσιάσουν κυτταροτοξική δράση εναντίον μη καρκινικών αυτόλογων ή αλλογενών κυττάρων. Επιπλέον, εμφανίζουν χαμηλό ρυθμό αύξησης, με αποτέλεσμα να είναι δύσκολο να αυξηθούν in vitro. Προκειμένου να παρακαμφθούν τα προβλήματα αυτά, στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα της ΝΚ92 κυτταρικής σειράς, τα οποία αφενός δεν εμφανίζουν κυταροτοξικότητα εναντίον αλλογενών κυττάρων και αφετέρου είναι εύκολο να αυξηθούν και να διατηρηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα σε in vitro καλλιέργεια. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα κύτταρα αυτά να μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε πρωτόκολλα ανοσοθεραπείας του καρκίνου, στη θέση των ΝΚ κυττάρων. Κύτταρα της ΝΚ92 κυτταρικής σειράς, τροποποιήθηκαν γενετικά με την χρησιμοποίηση ενός ρετροϊικού φορέα κλωνοποίησης, ο οποίος έφερε την αλληλουχία που κωδικοποιεί έναν χιμαιρικό υποδοχέα αποτελούμενο από το scFv τμήμα του ανθρώπινου αντί-HER-2/neu μονοκλωνικού αντισώματος συνδεδεμένο με τη ζ αλυσίδα του CD3 υποδοχέα του TCR συμπλέγματος των Τ λεμφοκυττάρων. Με αυτόν τον τρόπο τα ΝΚ92 κύτταρα είχαν τη δυνατότητα εκτός της μη ειδικής να εκδηλώνουν και ειδική κυτταροτοξική δράση, μέσω του χιμαιρικού του υποδοχέα. Η σύνδεση του χιμαιρικού τους υποδοχέα με θετικά για HER-2/neu καρκινικά κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων, με αποτέλεσμα την εκδήλωση κυτταροτοξικής δράσης εναντίον κυττάρων στόχων. Με πειράματα φάνηκε ότι τα γενετικά τροποποιημένα ΝΚ92 κύτταρα επιτελούν ένα βιολογικό κύκλο, ο οποίος ολοκληρώνεται μέσα σε περίπου 60 ημέρες. Μεταξύ 30ης και 50ης ημέρας καλλιέργειας οι ΝΚ92 κλώνοι εκφράζουν το χιμαιρικό τους υποδοχέα σε ποσοστό >95%, αυξάνονται με πολύ γρήγορο ρυθμό και εμφανίζουν κυτταροτοξική δράση εναντίον HER-2/neu θετικών κυτταρικών σειρών >80%. Στο χρονικό αυτό διάστημα, οι ΝΚ92 κλώνοι απελευθερώνουν το scFv τμήμα του χιμαιρικού τους υποδοχέα, το οποίο αναγνωρίζει τη HER-2/neu ογκοπρωτεΐνη που εκφράζεται στην επιφάνεια των HER-2/neu θετικών κυτταρικών σειρών. Το διαλυτό scFv παρουσιάζει κυτταροστατική δράση όταν προσδεθεί στη HER-2/neu ογκοπρωτεΐνη των HER-2/neu θετικών και εξαρτώμενων κυτταρικών σειρών, όπως είναι η SKBR3. Συνεπώς, τα γενετικά τροποποιημένα ΝΚ92 κύτταρα, τα οποία υπερεκφράζουν το χιμαιρικό υποδοχέα του ανθρώπινου αντί-HER-2/neu μονοκλωνικού αντισώματος, εμφανίζουν ένα διπλό τρόπο δράσης (κυτταροτοξικότητα και κυτταροστατικότητα) εναντίον των HER-2/neu θετικών και εξαρτώμενων κυτταρικών σειρών. Σύμφωνα με τα παραπάνω, διαπιστώνεται ότι η κατασκευή γενετικά τροποποιημένων κυτταροτοξικών κυττάρων, που να εκφράζουν και να εκκρίνουν ένα χιμαιρικό υποδοχέα που θα αναγνωρίζει ειδικά ένα συγκεκριμένο καρκινικό αντιγόνο ανοίγει νέους δρόμους στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου.