Ανοσοφαινοτυπική και κυτταρογενετική μελέτη στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία. Η συμβολή τους στην πρόγνωση της νόσου

Abstract

Background. Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a malignant clonal hematological disorder characterised by the accumulation of small mature CD5 expressing lymphocytes in bone marrow, blood, lymph nodes, liver and spleen.The disorder results in lymphadenopathy, organomegaly, cytopenias and immune dysfunction and is the most common leukemia affecting adults in the Western hemisphere. Although patients are mostly elderly, almost 30% are aged less than 55 years. Prognosis is quite variable with median survival ranging from a few months to several decades. The clinicopathologic classification systems can only partially predict the biology of CLL cases, the most validated prognostic factors being the presence of cytogenetic abnormalities, somatic mutations of genes encoding for the immunoglobulin heavy chain variable region (IgVH), the expression of ZAP-70 protein in clonal Blymphocytes and others. In the present research work we sought to study the immunohistochemical expression of ZAP-70 protein and molecular aberrations such as the methylation status of the Von Hippel Lindau (VHL) gene promoter and the methylation pattern of the DMR region encompassing the DLK1/MEG3 gene promoter. The latter gene is subject to an imprinted gene regulation pattern. The normal methylation pattern of MEG3 gene consists of 2 bands, one corresponding to the methylated paternal allele with a 160bp PCR product and an unmethylated maternal allele with a 120bp PCR product. We also investigated if the aforementioned parameters are of prognostic significance for patient outcome and whether they are correlated to clinical, pathologic and laboratory characteristics of the disease in a statistically significant way. The detection of methylation status of genes under study was performed in genomic DNA isolated from serum and bone marrow biopsy specimens. Methods. Genomic DNA was isolated from serum specimens and bone marrow biopsies from 41 CLL patients. The QIAamp DNA mini kit (Qiagen) was used for the extraction of DNA from both serum and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) bone marrow biopsies, with some modifications. The study of methylation status of gene promoters (VHL και MEG3) was done with the Μethylation-specific Polymerase Chain Reaction (MSP) technique. Initially, DNA was chemically processed with NaHSO3 using the EZ DNA MethylationTM kit (Zymo Research, USA), while for the MSP reaction the HotStarTaq Master Mix kit from Qiagen was used. The Polymerase Chain Reaction (PCR) took place in a final volume of 25μl that contained: HotStarTaq Master Mix (final concentration 1Χ PCR buffer, 2.5 units HotStarTaq DNA polymerase, 200Μm dNTP και 1.5mM MgCl2), 0.4μΜ of specific primers and 30ng of chemically modified DNA. In each PCR reaction a specimen not containing DNA and a commerciallly available specimen containing totally methylated DNA served as blind negative and positive controls, respectively. The presence of PCR products was detected by means of horizontal electrophoresis in 2,5% agarose gel. The immunohistochemical study of bone marrow biopsy sections was done according to the classical streptavidine-avidine-biotin technique. The monoclonal antibody used for study of cytoplasmic ZAP-70 expression was the mouse clone 2F3.2 (Cell Marque). Moreover, we studied the immunohistochemical expression of CD3, CD20, CD5 and CD23. Due to the small sample size, the statistical analysis of correlations between molecular and clinicopathologic parameters was performed by means of Pearson parametric and Spearmann non-parametric techniques. Descriptive studies of parameter correlations were undertaken by constructing contingency tables and application of the Chi-square test (χ2). Overall survival analyses were computed from the date of diagnosis to date of death or last follow-up with the Kaplan-Meier product limit method. Patient Characteristics. Forty-one CLL patients (36 males, 5 females) with a median age of 70 years were accrued in the study protocol, with all serum and bone marrow biopsy specimens being collected at the time of diagnosis. We managed to collect 38 serum, 37 bone marrow biopsy and 5 lymph node biopsy samples. 61% of patients received therapy until completion of study follow-up. ...........................................................................................................................................................

Η Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι κακοήθης κλωνική αιματολογική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση μικρών, ώριμων στην εμφάνιση CD5+ λεμφοκυττάρων, στο αίμα, στο μυελό των οστών, στους λεμφαδένες, στο ήπαρ και στο σπλήνα. Αποτέλεσμα αυτής της διαδικασίας είναι η λεμφαδενοπάθεια, η οργανομεγαλία, οι κυτταροπενίες και η ανοσολογική δυσπραγία. Η ΧΛΛ είναι η συχνότερη λευχαιμία των ενηλίκων στο δυτικό ημισφαίριο. Μολονότι η νόσος αφορά κυρίως ηλικιωμένους, δεν πρέπει να παραβλέπεται το γεγονός ότι το 30% των προσβεβλημένων ασθενών έχει ηλικία κάτω των 55 ετών. Η πρόγνωση της νόσου είναι εξαιρετικά ετερογενής, με διάμεση επιβίωση που κυμαίνεται από λίγους μήνες ως δεκαετίες. Τα κλινικοπαθολογικά συστήματα ταξινόμησης προβλέπουν τη βιολογική συμπεριφορά της νόσου μόνο μερικώς. Οι προγνωστικοί παράγοντες περιλαμβάνουν κυρίως την παρουσία κυτταρογενετικών ανωμαλιών, την παρουσία ή μη σωματικών μεταλλάξεων στη μεταβλητή περιοχή του γονιδίου της βαρειάς αλύσου των ανοσοσφαιρινών IgVH, την έκφραση της ZAP-70 πρωτεΐνης από τα κλωνικά Β- λεμφοκύτταρα και πληθώρα άλλων παραγόντων. Στην παρούσα διατριβή επιχειρείται η μελέτη της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης της ZAP-70 πρωτεΐνης και η μελέτη μοριακών παραμέτρων όπως: η κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου VHL και το πρότυπο μεθυλίωσης της DMR ρυθμιστικής περιοχής που περιλαμβάνει τον υποκινητή του γονιδίου DLK1/MEG3, που είναι γονίδιο υποκείμενο στο μηχανισμό της γονιδιωματικής αποτύπωσης. Ερευνήθηκε έαν οι παραπάνω παράμετροι είναι δυνητικά προγνωστικοί παράγοντες της νόσου και μελετήθηκαν οι στατιστικές τους συσχετίσεις με τα κλινικοεργαστηριακά χαρακτηριστικά της νόσου. Η ανίχνευση της μεθυλίωσης των υπό μελέτη γονιδίων έγινε σε γενωμικό DNA που απομονώθηκε από ορό και από τομές οστεομυελικής βιοψίας. Ο ορός επιλέχθηκε γιατί συνδυάζει απλή και εύκολη λήψη και γιατί σύμφωνα με τα βιβλιογραφικά δεδομένα είναι πολύτιμη πηγή ελεύθερου νεοπλασματικού DNA. Μέθοδοι Γενωμικό DNA απομονώθηκε από δείγματα ορού και δείγματα οστεομυελικής βιοψίας από 41 ασθενείς με ΧΛΛ. Για την απομόνωση γενωμικού DNA από δείγματα ορών, χρησιμοποιήθηκε το QIAamp DNA mini kit (Qiagen) και στην απομόνωση του γενωμικού DNA από βιοψίες μυελού των οστών σε τομές παραφίνης, χρησιμοποιήθηκε η ίδια μέθοδος με ορισμένες τροποποιήσεις. Η μελέτη της μεθυλίωσης των υποκηνιτών των υπό μελέτη γονιδίων (VHL και MEG3) έγινε με την τεχνική της ειδικής της μεθυλίωσης αντίδρασης PCR (Μethylation-specific PCR - MSP). Αρχικά το DNA υπέστη χημική κατεργασία με NaHSO3, χρησιμοποιήθηκε το EZ DNA MethylationTM kit (Zymo Research, USA). Για την αντίδραση MSP χρησιμοποιήθηκε το HotStarTaq Master Mix kit της Qiagen. Η PCR αντίδραση έλαβε χώρα σε τελικό όγκο 25μl, που περιείχε: HotStarTaq Master Mix (τελική συγκέντρωση 1Χ PCR buffer, 2.5 μονάδες HotStarTaq DNA πολυμεράση, 200Μm καθενός dNTP και 1.5mM MgCl2), 0.4μΜ των κατάλληλων εκκινητών και 30ng χημικά τροποποιημένου DNA. Για κάθε αντίδραση PCR παράλληλα με τα υπό μελέτη δείγματα εξετάζονταν και ένα δείγμα χωρίς DNA που λειτουργούσε ως τυφλό και ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ολικά μεθυλιωμένο DNA, που διατίθεται στο εμπόριο. Η παρουσία των προϊόντων της PCR αντίδρασης ανιχνεύθηκε με οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2,5%. Η ανοσοϊστοχημική μελέτη των οστεομυελικών βιοψιών έγινε με την κλασσική τεχνική στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Τo μονοκλωνικό αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της κυτταροπλασματικής έκφρασης του ZAP-70 ήταν το 2F3.2 mouse (Cell Marque). Επίσης, ελέγχθηκε η ανοσοϊστοχημική έκφραση των CD3, CD20, CD5 και CD23. Λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος των ασθενών (41), ο έλεγχος για την ύπαρξη συσχετίσεων μεταξύ παραμέτρων έγινε τόσο με τη μέθοδο Pearson όσο και με τη μέθοδο Spearmann. Η περιγραφική μελέτη των μεταβολών μιας μελετόμενης παραμέτρου σε συνάρτηση με άλλη παράμετρο έγινε με την κατασκευή πινάκων συνάφειας και με την εφαρμογή του Chi-square test (χ2). Ο προσδιορισμός της ολικής επιβίωσης έγινε από την ημερομηνία διάγνωσης ως τον θάνατο ή την τελευταία επίσκεψη του ασθενούς με τη μέθοδο Kaplan-Meier. ..........................................................................................................................................