L-καρνιτίνη και γήρανση: πειραματική και μορφολογική μελέτη με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

Abstract

Introduction: Aging is a continuous process during which there is accumulation of morphological and functional alterations that take place in a random manner in all living organisms. It is more severe in the postmitotic cells, which, due to their high degree of differentiation, have lost the ability to undergo mitosis and therefore renewal, and also they are more vulnerable to the oxidative stress because of the high energy demands and the corresponding high production of free radicals. Moreover, free radicals specifically attack the mtDNA and produce mutations which further cause the functional decline of the cell. L-carnitine exerts important effects at the metabolism of the postmitotic high energy demanding cells because of its role as the carrier of the fatty acids into the mitochondrion as well as an acetyl buffer. The administration of L-carnitine has been found to promote energy production by the mitochondria and increases the ability of the cell to overcome the deleterious effects of the age associated stress. The aim of this study was to explore the alterations of the ultrastructure of the postmitotic myocardial and muscle cell as well as the mitotic liver cell during aging, along with the effect of L-carnitine administration. Methods: We used male Wistar rats divided into three groups according to their age (group I = 5 months old, group II = 10 months old, group III = 18 months old). Every group consisted of one rat that received placebo, while the other rats received 300mg/kg/day L-carnitine intraperitonealy for 35 days. After the last day of administration all rats were anaesthetized and sacrificed, and tissue samples from the myocardium, the muscle and the liver were taken and were processed for transition electron microscopy. We measured the weights of all rats daily during the time of administration. The difference of the weights at the beginning and at the end of L-carnitine or placebo administration was analyzed statistically using t-test for paired observations. We counted all mitochondria that were recognized in the electron micrographs and we graded their morphology into three stages (stage 0 = normal morphology, stage 1 = edematous morphology, stage 2 = degenerated morphology). Finally, we calculated the mitochondria with the corresponding morphology as a fraction of the total number of the mitochondria that were recognized. Results: The ultrastructural study showed alterations in the myocardial and the muscle cell even at the age of 5 months. The significance of these alterations was greater in the 10-months old rat and especially in the 18-month old rat regarding the mitochondria, the sarcomeres, the endothelium and the sarcoplasmatic reticulum. The liver cell showed some changes concerning the accumulation of lipofuscin and the edematous mitochondria in the 18 months old rat. The administration of L-carnitine resulted in a significant improvement of the ultrastructural appearance of the postmitotic cells, but in a less important amelioration of the liver cell morphology. The rats that received the L-carnitine reduced their weight significantly (p<0,05 for group I, p<0,001 for group II and group III). The percentage of mitochondria with stage 0 morphology (normal mitochondria) in all types of cells increased after the administration of L-carnitine. Conclusion: Postmitotic cells emerge age related ultrastructural changes earlier than the mitotic liver cell. L-carnitine administration improved the mitochondrial morphology of all tissues that were studied as well as the ultrastructure of the postmitotic cells as a whole and reversed certain age related alterations.

Εισαγωγή: Η γήρανση είναι μια προοδευτική διαδικασία άθροισης ποικίλων μορφολογικών και λειτουργικών μεταβολών που συμβαίνουν με τυχαίο τρόπο σε όλα τα έμβια όντα. Είναι εντονότερη στα μεταμιτωτικά κύτταρα, τα οποία λόγω της υψηλής διαφοροποίησής τους έχουν χάσει την ικανότητα πολλαπλασιασμού και ανανέωσης και είναι ιδιαίτερα ευάλωτα στο οξειδωτικό stress εξαιτίας των αυξημένων ενεργειακών απαιτήσεων και της αντίστοιχα αυξημένης παραγωγής οξειδωτικών ριζών. Tο οξειδωτικό stress επιδρά ειδικότερα στο μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) με αποτέλεσμα την πρόκληση μεταλλάξεων και την ενεργειακή και λειτουργική έκπτωση του κυττάρου. H L-καρνιτίνη διαδραματίζει πρωτεύοντα ρόλο στο μεταβολισμό των κυττάρων με αυξημένες ενεργειακές απαιτήσεις, εξαιτίας των ρόλων της ως φορέας των λιπαρών οξέων εντός του μιτοχονδρίου αλλά και ως ρυθμιστής των ακετυλομάδων του μιτοχονδρίου. Η χορήγηση L-καρνιτίνης βρέθηκε ότι αυξάνει την ικανότητα παραγωγής ενέργειας από τα μιτοχόνδρια και καθιστά το κύτταρο περισσότερο ανθεκτικό στο stress της ηλικιακής φθοράς. Σκοπός της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η μεταβολή της υπερμικροσκοπικής υφής των μεταμιτωτικών κυττάρων του μυοκαρδίου και του γραμμωτού μυϊκού ιστού αλλά και των μη μεταμιτωτικών κυττάρων του ήπατος του επίμυ στη γήρανση καθώς και η επίδραση της L-καρνιτίνης. Μέθοδος : Χρησιμοποιήθηκαν άρρενες επίμυες Wistar χωρισμένοι σε ηλικιακές ομάδες των 5, 10 και 18 μηνών. Σε κάθε ομάδα υπήρξε ένας μάρτυρας που έλαβε εικονικό φάρμακο (φυσιολογικός ορός) ενώ οι υπόλοιποι επίμυες έλαβαν ενδοπεριτοναϊκά καρνιτίνη σε δόση 300mg/kg βάρους σώματος/ημέρα επί 35 ημέρες. Μετά την τελευταία ημέρα χορήγησης καρνιτίνης ακολούθησε θυσία των πειραματόζωων, λήψη ιστοτεμαχίων, επεξεργασία και μικροσκόπηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης. Επιπλέον, γινόταν καθημερινός προσδιορισμός του βάρους των επίμυων και η διαφορά βάρους στην αρχή και στο τέλος της χορήγησης καρνιτίνης αναλύθηκε στατιστικά με τη χρήση του κριτηρίου t για ζευγαρωτές παρατηρήσεις. Τα μιτοχόνδρια που αναγνωρίσθηκαν σε κάθε φωτογραφία του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου καταμετρήθηκαν και κατατάχθηκαν ανάλογα με τη μορφολογία τους σε τρία στάδια: στάδιο 0 = φυσιολογικά μιτοχόνδρια, στάδιο1 = οιδηματώδη μιτοχόνδρια, στάδιο 2 = εκφυλισμένα μιτοχόνδρια. Η αναλογία των μιτοχονδρίων εκφράστηκε σαν ποσοστό του συνολικού αριθμού των μιτοχονδρίων για κάθε ιστό και για κάθε ηλικιακή ομάδα. Αποτελέσματα: Η υπερμικροσκοπική μελέτη ανέδειξε αλλοιώσεις στα μυοκαρδιακά κύτταρα και στις γραμμωτές μυϊκές ίνες ακόμα και στην ηλικία των 5 μηνών, οι οποίες ήταν περισσότερο έντονες στην ομάδα των 10 και ιδιαίτερα στην ομάδα των 18 μηνών και αφορούσαν τα μιτοχόνδρια, τα σαρκομέρια, το ενδοθήλιο και το σαρκοπλασματικό δίκτυο. Οι αλλοιώσεις της υφής του ηπατικού κυττάρου ήταν εμφανείς κυρίως στην ομάδα των 18 μηνών και οι κυριότερες ήταν η παρουσία λιποφουσκίνης και τα οιδηματώδη μιτοχόνδρια. Η χορήγηση καρνιτίνης είχε ως αποτέλεσμα τη βελτίωση της συνολικής μορφολογικής εικόνας των μεταμιτωτικών κυττάρων του μυοκαρδίου και του γραμμωτού μυϊκού ιστού και λιγότερο του ήπατος. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι οι επίμυες που έλαβαν καρνιτίνη μείωσαν το βάρος τους (p<0,05 για την ομάδα των 5 μηνών, p<0,001 για την ομάδα των 10 μηνών και 18 μηνών). Η αναλογία των φυσιολογικών μιτοχονδρίων σε κάθε ιστό και σε κάθε ηλικιακή ομάδα παρουσίασε αύξηση μετά από τη χορήγηση καρνιτίνης. Συμπεράσματα: Τα μεταμιτωτικά κύτταρα εμφανίζουν ταχέως αλλοιώσεις ηλικιακής φθοράς σε αντίθεση με τα μιτωτικά κύτταρα. Η χορήγηση καρνιτίνης βελτιώνει τη μορφολογική εικόνα των μιτοχονδρίων του μυοκαρδίου, του γραμμωτού μυϊκού ιστού και του ήπατος αλλά και τη συνολική μορφολογία των μεταμιτωτικών κυττάρων και αναστρέφει ορισμένες από τις αλλοιώσεις της γήρανσης.