Επισήμανση και αξιολόγηση rgd πεπτιδικών παραγώγων για απεικόνιση της αγγειογένεσης

Abstract

The aim of the present project is the study of the labeling of two novel derivatives of the cyclic peptide cRGDfK (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) with 99mTc(I). The derivatives which were synthesized and studied were cRGDfK-His and cRGDfK-CPA. The pentapeptide cRGDfK was synthesized by employing the SPPS method on an o-chloro-amidomethylpolystyrene resin, according to the F-moc strategy. The two bifunctional chelating agents, His and CPA, were linked to the peptide moiety via the Nε­-amino group of Lys. The labeling of both derivatives was performed via the technetium precursor [99mTc(H2O)3(CO)3]+ and led to the formation of one labeled product each time, with a yield of more than 98%. The effect of heating time and peptide concentration on the labeling of the peptides was next studied. It was found that for >20 min heating, the formation of cRGDfK-His-99mTc(H2O)(CO)3 and cRGDfK-CPA-99mTc(CO)3 occurs in high percentages (>98%). From the study it was found that both peptide derivatives can be labeled in high yields, even at very low concentrations; cRGDfK-His: 10-5Μ (>87%) and cRGDfK-CPA: 5 / 10-5Μ (>93%). The in vitro stability of the labeled peptide derivatives was studied: a) at different time-points, b) in the presence of an excess of His and Cys, c) in human plasma, d) in human serum and e) in liver and kidney homogenates. Both products remain quite stable under these conditions, since no decomposition/exchange is noticed, while cRGDfK-CPA-99mTc(CO)3 is a bit more stable than cRGDfK-His-99mTc(H2O)(CO)3 in human serum. A good percentage of both labeled compounds internalizes quickly in vitro in cancer cells and no capture of radioactivity is observed. The study and comparative evaluation of the in vivo behavior and the pharmacokinetic properties of the radiolabeled products were assessed after their biodistribution in normal mice and pathological scid mice with breast cancer. From the comparative biodistribution study of the two radiolabeled peptide derivatives, it was found that both have fast blood clearance, with cRGDfK-His-99mTc(H2O)(CO)3 remaining for a longer time than cRGDfK-CPA-99mTc(CO)3 in all organs examined. Both are eliminated via the hepatobiliary and urinary systems. The percentage of tumor uptake at 30min p.i. was higher for cRGDfK-His-99mTc(H2O)(CO)3 (2,79 ± 1,48% ID/G) than for cRGDfK-CPA-99mTc(CO)3 (4.14 ± 1,52% ID/g). Scintigraphic studies showed that the tumor could be better visualized between 20 and 40min p.i. for both radiolabeled compounds. The fact that imaging is not very clear can be attributed to the high radioactive concentration in the abdominal area. It was finally concluded that the smaller the size of the tumor, the higher the concentration of the radiolabeled peptide derivative in the tumor area

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η μελέτη της επισήμανσης δύο νέων παραγώγων του κυκλικού πεπτιδίου cRGDfK (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) με 99mTc(Ι). Τα παράγωγα που συντέθηκαν και μελετήθηκαν ήταν το cRGDfK-His και το cRGDfK-CPA. Το πενταπεπτίδιο cRGDfK συντέθηκε με τη μέθοδο της SPPS πάνω σε μια ο-χλωρο-αμιδομεθυλοπολυστυρενική ρητίνη ακολουθώντας την Fmoc στρατηγική. Στο μόριο του πεπτιδίου συζεύχθηκαν μέσω της Nε-αμινομάδας της Lys οι δύο περιφερειακοί υποκαταστάτες His και CPA. Η επισήμανση των παραγώγων έγινε μέσω του προσυμπλόκου [99mTc(H2O)3(CO)3]+ και οδήγησε στο σχηματισμό ενός επισημασμένου προϊόντος κάθε φορά με απόδοση >98%. Ακολούθως μελετήθηκαν η επίδραση του χρόνου θέρμανσης και της συγκέντρωσης του πεπτιδίου στην επισήμανση. Βρέθηκε ότι για χρόνους θέρμανσης ?20min ο σχηματισμός των cRGDfK-His-99mTc(H2O)(CO)3 και cRGDfK-CPA-99mTc(CO)3 λαμβάνει χώρα σε υψηλό ποσοστό (>98%). Από τη μελέτη προέκυψε ότι και τα δύο πεπτιδικά παράγωγα μπορούν να επισημανθούν σε μεγάλο ποσοστό, ακόμα και σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. cRGDfK-His: 10-5Μ (>87%) και cRGDfK-CPA: 5 / 10-5Μ (>93%). Η in vitro σταθερότητα των επισημασμένων πεπτιδικών παραγώγων μελετήθηκε: α) με την πάροδο του χρόνου, β) παρουσία περίσσειας His/Cys, γ) παρουσία ανθρώπινου πλάσματος, δ) παρουσία ανθρώπινου ορού και ε) σε ομογενοποιήματα νεφρών και ήπατος. Και τα δύο επισημασμένα πεπτιδικά παράγωγα παρουσιάζουν ικανοποιητική σταθερότητα στις παραπάνω συνθήκες, αφού δεν παρατηρείται σε καμία περίπτωση κανενός είδους διαμοριακή ανταλλαγή/αντικατάσταση, ενώ το cRGDfK-CPA-99mTc(CO)3 είναι λίγο σταθερότερο από το cRGDfK-His-99mTc(H2O)(CO)3 μετά από επώαση σε ανθρώπινο ορό. Και τα δύο παράγωγα εσωτερικοποιούνται γρήγορα και σε αρκετά μεγάλο ποσοστό σε καρκινικά κύτταρα, ενώ δεν παρατηρείται εγκλωβισμός της ραδιενέργειας σε αυτά. Η μελέτη και συγκριτική αξιολόγηση της in vivo συμπεριφοράς των προϊόντων έγινε μετά από βιοκατανομή τους σε φυσιολογικούς μυς άλλα και σε παθολογικά πρότυπα καρκίνου. Από τη συγκριτική μελέτη της βιοκατανομής τους βρέθηκε ότι και τα δύο παρουσιάζουν παρόμοια, ταχεία αιματική κάθαρση, με το cRGDfK-His-99mTc(H2O)(CO)3 να παραμένει για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στον οργανισμό συγκριτικά με το cRGDfK-CPA-99mTc(CO)3. Η αποβολή και των δύο επισημασμένων RGD πεπτιδικών παραγώγων γίνεται κατά πρώτο λόγο μέσω του ηπατοχολικού και κατά δεύτερο μέσω του ουροποιητικού συστήματος. Το ποσοστό πρόσληψης στον όγκο 30min p.i. ήταν υψηλότερο για το cRGDfK-CPA-99mTc(CO)3 (4.14 ± 1,52% ID/g) από ότι για το cRGDfK-His-99mTc(H2O)(CO)3 (2,79 ± 1,48% ID/G). Οι σπινθηρογραφικές μελέτες έδειξαν ότι ο όγκος ήταν πιο διακριτός στο χρονικό διάστημα από 20 μέχρι 40min p.i. και για τα δύο. Το ότι δεν λαμβάνεται ευκρινής σπινθηρογραφική απεικόνιση οφείλεται στη μεγάλη ραδιενεργή συγκέντρωση στην κοιλιακή περιοχή. Τέλος διαπιστώθηκε ότι όσο μικρότερος σε μέγεθος είναι ο όγκος τόσο μεγαλύτερος είναι ο εντοπισμός του επισημασμένου πεπτιδικού παραγώγου σε αυτόν.