Δομική μελέτη υπερμοριακών συστημάτων. Μοριακή δομή του συμπλόκου των ανοσοσφαιρινικών περιοχών Ζ1 και Ζ2 της τιτίνης με την τελετονίνη

Abstract

Titin is the largest polypeptide yet discovered, a giant multi-domain protein from vertebrate striated muscles of about 1.2 μm length, spanning through one half of the mus-cle sarcomere, from the Z-disk to the central M-line. Titin’s main functions are: 1. In the thick (myosin) filament part of the myofibril the titin molecule regulates exact myosin assembly by acting as a giant template or “protein-ruler”. 2. The remainder of the titin molecule forms an elastic connection between the end of the thick filaments and the Z-disk. These connections give muscle its passive tension and they also keep thick filaments centered between Z-discs. The N-terminus of titin consists of two immunoglobulin-like (IG) domains, re-ferred as Z1Z2 domains and interacts with a 19 kD sarcomeric protein, known as tele-thonin. Telethonin, a 167aa protein, is found exclusively in striated and cardiac muscle providing spatially defined binding sites for other sarcomeric proteins at the N terminal of titin. Scope of this Thesis is the structural determination of the complex between the amino-terminal end of titin (Z1Z2) with telethonin. Both telethonin and Z1Z2 were cloned into pET 3d vector modified to contain His-Tag and TEV cleavage site. The plasmids were used to co-transform E.coli BL21. Initially, when telethonin overexpressed produced inclusion bodies. In order to resolve this solubility problem, we purified telethonin from inclusion bodies. Further problems arose during the purification. telethonin prone to oxidation and degradation. In order to resolve the oxidation problem we mutated the five cystein residues of telethonin into ser-ine residues. Truncation was the solution to the degradation problem. This truncated form, consisted of the N-terminal first 90 amino acids and it was enough to form complex with Z1Z2. We succeeded in crystallizing two forms of the complex: with the full length mu-tated telethonin (F167) in P21 unit cell, and with mutated and truncated telethonin (T90) in P21212 unit cell. The complex was crystallized with PEG 35k and MgSO4 under acidic 216 conditions. We optimized using the hanging drop method. Macroseeding was necessary in order to obtain crystals. The temperature of 25oC proved better than any lower one. For the phase determination was held three-wavelength anomalous dispersion measurement, using crystals from a selenium-methionine sample of the truncated protein complex under cryoconditions. The positions of the anomalous scatterers (4 seleniums at telethonin) were de-termined through the Patterson function and refined. The initial phases were determined upon these positions and then improved by density modification. The sceletonization of the derived map, made clear the positions of the IG domains and most of telethonin. The model was built with the graphics software O, refining each time the intermediate models using simulating annealing and torsion angle dynamics. Water molecules were added when the model was satisfactory complete. The final model was refined pseudo-anisotropically at maximum resolution of 2.45A, giving Rfree of 26.3%

Η τιτίνη είναι το μεγαλύτερο πεπτίδιο των σπονδυλωτών, μία γιγαντιαία πρωτε-ΐνη των μυών μήκους περίπου 1.2μm, που εκτείνεται κατά μήκος του μισού μυϊκού σαρ-κομερούς, από τον Ζ-δίσκο μέχρι την Μ-γραμμή. Οι κύριες λειτουργίες της τιτίνης είναι: 1. Στο τμήμα του παχέος νήματος (μυοσίνη) των μυοϊνιδίων, το μόριο της τιτίνης ρυθμί-ζει την ακριβή αρμολόγηση δρώντας ως ένας πρωτεϊνικός κανόνας 2. Το υπόλοιπο μόριο της τιτίνης σχηματίζει ελαστικούς συνδέσμους μεταξύ του τέλους του παχέος νήματος και του Ζ-δίσκου. Αυτοί οι σύνδεσμοι επιτρέπουν στο μυ να έχει πα-θητική τάση και επίσης διατηρούν τα παχέα νήματα κεντρωμένα μεταξύ των Ζ-δίσκων. Το αμινοτελικό τμήμα της τιτίνης αποτελείται από δύο ανοσοφαιρινικές περιοχές, αποκαλούμενες Ζ1Ζ2 και αλληλεπιδρά με μία άλλη πρωτεΐνη του σαρκομερούς, μο-ριακού βάρους 19kD, την τελετονίνη. Η τελετονίνη, μία πρωτεΐνη 167 αμινοξέων, εντο-πίζεται αποκλειστικά στους καρδιακούς και γραμμωτούς μυς, παρέχοντας χωροταξικά καθορισμένα σημεία σύνδεσης με άλλες πρωτεΐνες του σαρκομερούς στο αμινοτελικό άκρο της τιτίνης. Η παρούσα Διατριβή αναφέρεται στο δομικό προσδιορισμό του συ-μπλόκου του αμινοτελικού άκρου της τιτίνης (Ζ1Ζ2) με την τελετονίνη. Η Ζ1Ζ2 και η τελετονίνη εκφράστηκαν σε βακτήρια E.coli του στελέχους BL21(DE3). Το cDNA που τις κωδικοποιεί τους εισήχθη στο πλασμίδιο pET3d της No-vagen με την προσθήκη στο 5΄ άκρο βάσεων αποκωδικοποίησης σήμανσης έξι ιστιδινών ακολουθούμενες από την ειδική αλληλουχία που αναγνωρίζεται ειδικά από την πρωτεάση TEV. Η τελετονίνη υπερεκφράζεται σε σωμάτια εγκλεισμού και καθαρίζεται με ανάλογο πρωτόκολλο. Κατά τον καθαρισμό της εμφανίστηκαν προβλήματα οξείδωσης και αποι-κοδόμησης της. Το πρόβλημα της οξείδωσης αντιμετωπίστηκε μεταλλάσσοντας τις πέντε κυστεΐνες του μορίου σε σερίνες. Το πρόβλημα της αποικοδόμησης αντιμετωπίστηκε δια-τηρώντας μόνο τα 90 αμινοτελικά αμινοξέα της τελετονίνης, τα οποία αρκούσαν για το σχηματισμό του συμπλόκου με την Ζ1Ζ2. 214 Κρυσταλλώθηκαν δύο μορφές του συμπλόκου: με την πλήρη και μεταλλαγμένη τελετονίνη (F167) σε ομάδα χώρου Ρ21, και με την μεταλλαγμένη και κομμένη τελετονί-νη (T90) σε ομάδα χώρου Ρ212121. Το σύμπλοκο κρυσταλλώθηκε με PEG 35k και MgSO4 σε όξινο περιβάλλον. Οι συνθήκες βελτιστοποιήθηκαν με την τεχνική της κρεμά-μενης σταγόνας στους 25οC, ενώ η τεχνική σποράς αποδείχθηκε απαραίτητη για καλής ποιότητας κρυστάλλους. Για τον προσδιορισμό των αρχικών φάσεων πραγματοποιήθηκε πείραμα πολλα-πλής ανωμάλου διασποράς στο σύμπλοκο Τ90 το οποίο περιείχε σεληνιομένες μεθειονί-νες υπό κρυογονικές συνθήκες. Οι θέσεις των ανωμάλων σκεδαστών (4 σελήνια στην τελετονίνη) προσδιορίστηκαν από τη συνάρτηση Patterson και βελτιστοποιήθηκαν. Με βάση αυτές τις θέσεις προσδιορίσθηκαν οι αρχικές φάσεις οι οποίες βελτιώθηκαν με εξο-μάλυνση διαλύτη. Στον αρχικό χάρτη ηλεκτρονιακής πυκνότητας εντοπίστηκαν οι θέσεις των τεσσάρων ανοσοσφαιρινικών περιοχών και της τελετονίνης. Επακολούθησε σειρά βελτιστοποιήσεων που περιελάμβανε κατασκευή μοντέλου στο πρόγραμμα γραφικών ‘Ο’, και βελτιστοποίηση του με τη χρήση προσομοιωμένης εκτόνωσης και περιορισμούς ελευθερίας. Όταν το μοντέλο ήταν αρκετά ικανοποιητικό προστέθηκαν μόρια διαλύτη και τελικά βελτιστοποιήθηκε ψευδο-ανισοτροπικά σε μέγιστη διακριτική ικανότητα 2.45A, με τιμή παράγοντα βελτιστοποίησης Rfree 26.3%