Μελέτη του συστήματος μεταφοράς σήματος δύο συστατικών AtoS-AtoC και η συμβολή του στη ρύθμιση κυτταρικών λειτουργιών μικροοργανισμών

Abstract

The aim of this work was to define the functions at the molecular level of the histidine kinase of E. coli AtoS-AtoC two component system. AtoS sensor kinase plays a central role in this system, since upon acetoacetate induction, through phosphotransfer, regulates the expression of the atoDAEB operon genes, whose products are required for short-chain fatty acid catabolism. In an effort to experimentally clarify the mode of AtoS autophosphorylation, purified recombinant wild-type and mutant AtoS forms were used to prove that these proteins are true sensor kinases. The phosphorylated residue was identified as the histidine-398, which was located in a conserved «Η-box» since AtoS carrying H398L mutation at this site failed to autophosphorylate and furthermore the AtoS(H398L) failed to promote the acetoacetate-dependent inducibility of atoDAEB operon. This inability to autophosphorylate was not due to gross structural alterations of AtoS since the H398L mutant retained its capability to bind ATP. Furthermore, the H398L mutant AtoS was competent to catalyze the trans-phosphorylation of an AtoS G2-box (G565A) mutant protein which otherwise failed to autophosphorylate due to its inability to bind ATP. The formation of homodimers between the various AtoS proteins, as a prerequisite for AtoS trans-autophosphorylation, was also shown by cross-linking experiments both in vitro and in vivo. AtoS dimerization is not ligandinduced since acetoacetate did not affect AtoS behaviour as a dimer. In the present study was also investigated the mechanism of polyaminemediated induction of AtoC in E. coli, which has a dual function as the positive transcriptional regulator of the atoDAEB operon genes and a non-competitive protein inhibitor of ODC, controlling polyamine biosynthesis in E. coli. The roles of polyamines on the transcription of atoC gene as well as their effects on other genes that share a topological and/or functional relevance with atoDAEB operon were studied. Polyamines, act at the transcriptional level, since they caused activation of atoC transcription in three E. coli strains but not to other genes tested. In addition, a selection of synthetic polyamine analogues have been synthesized and tested as tools for monitoring the mechanism(s) of action of natural polyamines. The effects of these compounds were determined in different biological processes such as their effectiveness in inducing the expression of atoC and atoDAEB operon, their effect on ODC activity and AtoS kinase activity and on the growth of polyamine-deficient E. coli. Experimental data verified that putrescine and diaminopropane analogues, activated atoC transcription, indicative of the structural requirements of diamines for atoC induction. Some of these analogues also activated the atoDAEB and the most potent one, enhanced cytoAtoS kinase activity. In addition, this atoC induction resulted in accumulation of AtoC protein and inhibition of ODC activity. This inhibition is likely due to the formation of inactive ODC-AtoC complexes, since polyamine analogues did not affect the ODC protein levels.

Η διατριβή αυτή είχε ως πρωταρχικό στόχο την μελέτη της λειτουργικότητας σε μοριακό επίπεδο της κινάσης του συστήματος μετάδοσης σήματος δύο συστατικών AtoS-AtoC στο βακτήριο E. coli. Η κινάση AtoS αποτελεί τον πυρήνα του συστήματος που έπειτα από επαγωγή από ακετοξικό, διαμέσου φωσφομεταφοράς, ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων του atoDAEB οπερονίου για τον καταβολισμό λιπαρών οξέων μικρής αλυσίδας. Η μελέτη του μηχανισμού αυτοφωσφορυλίωσης της AtoS ξεκίνησε με την πειραματική απόδειξη πως καθαρισμένες ανασυνδυασμένες μορφές της AtoS (μεταλλαγμένες και αγρίου τύπου) δρουν ως πραγματικές κινάσες. Το υποψήφιο προς φωσφορυλίωση αμινοξύ ταυτοποιήθηκε ως η ιστιδίνη Η-398 που εντοπίζεται στο συντηρημένο «Η-κουτί», έπειτα από την αδυναμία αυτοφωσφορυλίωσης του μεταλλάγματος Η398L καθώς και την αδυναμία της μεταλλαγμένης AtoS(H398L) στην επαγωγή από το ακετοξικό του atoDAEB οπερονίου. Η ανικανότητα αυτοφωσφορυλίωσης δεν οφειλόταν σε μεγάλες δομικές αλλαγές στη διαμόρφωση της AtoS εφόσον το Η398L μετάλλαγμα επανάκτησε την ικανότητα δέσμευσης του ATP. Επιπρόσθετα, το Η398L μετάλλαγμα της AtoS συναγωνίζεται στο να καταλύσει την trans-φωσφορυλίωση σε μια μεταλλαγμένη στο «G2-κουτί» AtoS (G565A) που διαφορετικά αποτυγχάνει να αυτοφωσφορυλιωθεί εξαιτίας της ανικανότητάς της στη δέσμευση του ATP. O σχηματισμός ομοδιμερών ως απαραίτητη προϋπόθεση για τον μηχανισμό trans-αυτοφωσφορυλίωσης της AtoS αποδείχθηκε με πειράματα χημικής σταυροσύνδεσης τόσο in vitro όσο και in vivo για όλες τις ανασυνδυασμένες μορφές της AtoS. Ο διμερισμός της AtoS δεν επάγεται από το μοριακό σήμα, εφόσον η παρουσία του ακετοξικού δεν επηρέασε την ενδοκυττάρια συμπεριφορά της AtoS ως διμερούς. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε επίσης ο μηχανισμός επαγωγής του AtoC από τις πολυαμίνες στην E. coli, εξαιτίας της διπλής του λειτουργίας ως θετικός μεταγραφικός ρυθμιστής του atoDAEB οπερονίου και ως μη συναγωνιστικός αναστολέας της ODC στη ρύθμιση της βιοσύνθεσης των πολυαμινών. Εξετάστηκε ο ρόλος των πολυαμινών στην μεταγραφή του atoC και παράλληλα ξεκαθαρίστηκαν οι επιδράσεις τους στη μεταγραφή άλλων γονιδίων που μοιράζονται τοπολογική και/ή λειτουργική συγγένεια με το atoDAEB οπερόνιο. Οι πολυαμίνες δρουν στο μεταγραφικό επίπεδο, όπως αποδείχθηκε από την εξειδικευμένη μεταγραφική ενεργοποίηση του atoC σε τρία διαφορετικά κυτταρικά στελέχη. Επιπρόσθετα, μια ομάδα από ανάλογα πολυαμινών συντέθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν ως εργαλεία για την διευκρίνιση του τρόπου δράσης των φυσικών πολυαμινών. Οι επιδράσεις αυτών των ενώσεων ελέγχθηκαν σε διάφορες βιολογικές διεργασίες όπως η επαγωγή της έκφρασης του atoC καθώς και του atoDAEB οπερονίου, η ρύθμιση της δραστικότητας της ODC και της δράσης κινάσης AtoS, καθώς επίσης και η ανάπτυξη του πολυαμινο-εξαρτώμενου E. coli στελέχους. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν πως τα ανάλογα πουτρεσκίνης και διαμινοπροπανίου ενεργοποίησαν τη μεταγραφή του atoC, ενδεικτικό των δομικών απαιτήσεων των διαμινών για την επαγωγή του. Ορισμένα ανάλογα ενεργοποίησαν και το atoDAEB ενώ το πιο δραστικό ανάλογο ενίσχυσε την δράση κινάσης της κυτταροπλασματικής μορφής της AtoS. Επιπρόσθετα, η επαγωγή του atoC προκάλεσε την αντίστοιχη συσσώρευση των ενδοκυττάριων πρωτεϊνικών επιπέδων του και την επακόλουθη αναστολή της δραστικότητας της ODC. Αυτή η αναστολή πιθανότατα να οφείλεται στη δημιουργία ανενεργών συμπλόκων ODC-AtoC, εφόσον τα ανάλογα πολυαμινών δεν επηρέασαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα της ODC.