Μοριακός και βιογεωχημικός χαρακτηρισμός των μικροοργανισμών που εμπλέκονται στην αναερόβια οξείδωση του μεθανίου και τη μεθανιογένεση σε ιζήματα μεθανιοϋδριτών της Ανατολικής Μεσογείου

Abstract

Cold seeps and gas hydrates sediments have an intrinsic role in the carbon cycle and therefore have become environments of intensive study in recent years. They function as energy source for chemosynthetically based life, can be used as potential energy resource and play an important role in slope stabilization. Sulfide and methane are available in high concentrations and support a variety of highly adapted microorganisms and symbiont-bearing invertebrates. The anaerobic oxidation of methane (AOM) is a key biogeochemical process at cold seeps and is assumed to be coupled to sulfate reduction and mediated by a consortium of anaerobic methanotrophic Archaea (ANME) and sulfate-reducing Bacteria (SRB). AOM acts as a scavenger to significant amounts of methane which could otherwise be released in the atmosphere, contributing, to climate change. Another sink for methane in the ocean is the aerobic oxidation of methane (MOx) whilst methane can be produced by microbially mediated Methanogenesis. Active methane seeps and gas hydrates have been identified on a number of mud volcanoes (MV) in the Anaximander Mountains, East Mediterranean Sea. The structure of highly complex prokaryotic communities harboured in marine sediments is dictated by rapid changes of physical and geochemical factors along sediment depth in hot-spot sites, like MVs. In this thesis, sediment from two mud volcanoes, Amsterdam and Kazan were analysed and it was investigated whether (a) the community structure of Bacteria and Archaea vary concomitantly, (b) the prokaryotic assemblages are dominated by one or several phylotypes with different relative abundances, implying a specific or an opportunistic community, respectively, and also (c) which of these specific communities are involved in biogeochemical processes related to mud volcanism. Sediment samples were sampled every 5 cm of the top 30 cm sediment and the distribution of specific biomarkers derived from ANME groups and SRB were investigated. High abundances of sn-2,3-di-O-isoprenoidal glycerol ethers (mainly archaeol and sn-2- hydroxyarchaeol) were retrieved. The concentrations measured were much higher (3 to 12 times) in Amsterdam sediments related to Kazan. In Amsterdam MV, maximum in archaeal biomarker abundances at 15-20 cmbsf (cm below sea floor) horizon correlated with the methane-sulfate transition zone and the measured concentrations are the highest reported so far for mud volcano’s sediments. In Kazan MV two local maxima were present at horizons 5-10 and 20-25, whereas the primer transition zone seemed to be placed from 7 to 13 cmbsf and a minor one at 20 to 25 cmbsf. Specific bacterial markers such us C16:1ω7c, C18ω:17c showed dominance of sulphide oxidizing Bacteria (SOx) in the upper layers for both volcanoes. Characteristic fatty acids C16:1ω5c, cyC17:0ω5,6 for AOM related SRB were also present in high concentrations. The vertical distribution of the archaeal and bacterial community composition was studied further with the construction of 16SS RNA gene libraries from the same sites of Amsterdam and Kazan MVs. The vast majority of all archaeal phylotypes retrieved in both mud volcanoes belong to Euryarchaeota. In Amsterdam MV, ANME-1 and ANME-2 seem to co-dominate all archaeal libraries constructed except the one from 30 cmbsf horizon, where ANME-3 was the dominant group. In bacterial clone libraries Proteobacteria (mainly γ-, δ- and ε- groups) dominated 0 and 5 cmbsf. Choloflexi- affiliated phylotypes were present in all sediment layers and dominated 10 cmbsf horizon. Phylotypes belonging to candidate division JS1 were also present in all sediment horizons but exhibited their highest relative abundance at 15 cmbsf. Phylotypes affiliated with δ-Proteobacteria had significant representation in all bacterial libraries and showed substantial percentage at 25 cmbsf. The vast majority of all bacterial phylotypes retrieved was closely related with methane seeps and gas hydrate environments. They were affiliated with putative sulfate-reducers, sulfide oxidizers, sulfur reducers and methylotrophs. In Kazan MV, the majority of the archaeal phylotypes were related to uncultivated members of ANME-2, from habitats where AOM occurs. ANME-1 and ANME-3 groups were also present. In bacterial clone libraries from Kazan MV, Proteobacteria were the most abundant and diverse bacterial group, with the γ-Proteobacteria dominating in most sediment layers and were related to members from marine sediments involved in methane cycling. The δ-Proteobacteria included several of the sulfate-reducers known to co-occur with anaerobic methane oxidizers. The rest of the bacterial phylotypes were shared among 15 known phyla, with cultured and uncultured representatives, and three unaffiliated groups. In most cases, these phylotypes represented microorganisms from similar, marine and non-marine, habitats. Diversity was calculated by Shannon-Wiener diversity index (H) and Pielou evenness index (J). The Shannon diversity index for Archaea was lower than for Bacteria in the same sediment horizon but indices did not co-vary for the two groups with sediment depth. For the archaeal communities H was calculated in Amsterdam MV between 0.99 - 1.72 and in Kazan MV 0.56 - 1.73. For the bacterial communities, H varied between 1.92 - 4.03 and 1.47 - 3.82 for Amsterdam and Kazan MV, respectively. Pielou index showed similar distribution pattern with H in most horizons. Cluster analysis using Morita similarity index revealed that more similarities are shared within different layers from the same MV rather than between the two volcanoes. The level of similarity of bacterial communities, with the exception of the communities at 15 and 20 cmbsf for both volcanoes, was low when phylotypes were used, indicating little overlap across the rest sediment layers. So apart from the clustered 15/20 horizons, each of the other horizons appeared to be a different habitat containing its own unique community of bacteria. The presence and the functional diversity of Archaea involved in methane metabolism (methanotrophs and methanogens) were investigated by detection and phylogenetic analysis of mcrA gene. This gene encodes for methyl-coenzyme M reductase, an essential enzyme in both anaerobic methane oxidation and methane production. The mcrA gene was present in all sediment horizons at Amsterdam MV and in all, but the surface horizon at Kazan MV. Putative methane produces related to Methanogenium organophilum were detected only in the deepest analyzed sediment layer for both MVs. The rest of the phylotypes were affiliated with functional group mcr a,b, mcr c, mcr e and mcr f. Generally, the results of mcrA analysis are in agreement with the phylogenetic analysis of 16S rRNA gene for Kazan MV. In the case of Amsterdam MV there seems to be a failure in 146 detecting mcr a,b group (corresponding to ANME-1) at 15 and 20 cmbsf. AOM is a significant biogeochemical process in many cold-seep sediments, evident in everything from pore water and sedimentary geochemical profiles to authigenic carbonates to (chemosynthetic) macrofaunal abundance and diversity. In sediments from both Amsterdam and Kazan mud volcano, measured pore water profiles of the concentrations of sulfate, sulfide, detected high values of archaeol and hydroxyarchaeol and bacterial biomarkers, retrieved phylotypes in both 16s rRNA gene and mcrA gene libraries, all indicate that AOM is presently occurring in the sediments of these two mud volcano. Differences in the size, methane concentrations and fluxes, sedimentological and geochemical characteristics and eruptive history between Amsterdam and Kazan MV (two geographically close mud volcanoes) have probably led to the formation on different prokaryotic communities in each of them. Moreover, for each mud volcano, it seems that mud volcanism shapes mixed prokaryotic communities at the domain level, with Archaea following different diversity patterns with sediment depth than Bacteria. Archaeal ribosomal RNA gene sequences are consistent with dominance of AOM-like organisms, while the majority of recovered bacterial sequences affiliate with sulfate-reducers, sulfide oxidizers, sulfur reducers and methylotrophs.

Οι μεθανιοϋδρίτες και οι υποθαλάσσιες πηγές μεθανίου έχουν προσελκύσει την προσοχή των επιστημόνων τα τελευταία χρόνια λόγω του οικολογικού, οικονομικού και εξελικτικού τους ενδιαφέροντος. Διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον κύκλο του άνθρακα, αποτελούν δυνητικές πηγές ενέργειας, ενώ παράλληλα μετέχουν στη σταθεροποίηση των ηπειρωτικών περιθωρίων. Λειτουργούν ως πηγή ενέργειας για χημειοσυνθετικού τρόπου ζωής κοινότητες, καθώς μεθάνιο και σουλφίδιο, που υπάρχουν σε υψηλές συγκεντρώσεις, τροφοδοτούν μικροοργανισμούς και βενθικούς οργανισμούς που φέρουν συμβιώτες. Η Αναερόβια Οξίδωση του Μεθανίου (ΑΟΜ) είναι σημαντική γεωχημική διεργασία σε αυτά τα περιβάλλοντα ωστόσο δεν έχει διερευνηθεί πλήρως μέχρι σήμερα. Πιστεύεται ότι διενεργείται σε σύζευξη με τη θειική αναγωγή, μέσω μίας μικροοργανισμικής συντροφίας μεθανιότροφων Αρχαίων (ANME) με θεικοαναγωγικά Βακτήρια. Η ΑΟΜ λειτουργεί ως ένα ιδιαιτέρως αποδοτικό φίλτρο, καθώς δεσμεύει περισσότερο από το 80% του μεθανίου που παράγεται στα υποθαλάσσια ιζήματα. Το μεθάνιο αυτό, αν απελευθερωνόταν στην ατμόσφαιρα, θα ενίσχυε σημαντικά το φαινόμενο του θερμοκηπίου και τις σχετιζόμενες με αυτό πλανητικές αλλαγές. Άλλη οδός κατανάλωσης του μεθανίου είναι η αερόβια οξίδωση του μεθανίου (ΜΟx) που λαμβάνει χώρα σε οξυγώμενα στρώματα ιζήματος ή νερού. Ενώ μεθάνιο μπορεί να παραχθεί μέσω της μικροοργανισμικής Μεθανιογένεσης. Μεθανιοϋδρίτες και ψυχρές αναβλύσεις έχουν βρεθεί στα υποθαλάσσια ηφαίστεια ιλύος του Αναξίμανδρου στην Ανατολική Μεσόγειο. Η δομή των προκαρυωτικών κοινοτήτων στα θαλάσσια ιζήματα καθορίζεται από τις μεταβολές των φυσικοχημικών και γεωχημικών παραγόντων κατά μήκος του ιζήματος. Οι μεταβολές στις βιοκοινότητες κατά μήκος δύο πυρήνων ιζήματος, μία από το υποθαλάσιο ηφαίστειο ιλύος Amsterdam και μία από το υποθαλάσσιο ηφαίστειο ιλύος Kazan εξετάστηκαν στα πλαίσια της παρούσας διατριβής με στόχο τη διερεύνηση, σε υψηλή κατακόρυφη ανάλυση, της βιοποικιλότητας και οικοφυσιολογίας των μικροοργανισμών που εμπλέκονται στο σχηματισμό (μεθανιογένεση) και δέσμευση (οξίδωση) του μεθανίου.. Δείγματα ιζήματος συλλέχθηκαν, κάθε 5 cm από την επιφάνεια ως τα 30 cm, πυρήνων ιζήματος και ταυτοποιήθηκαν χαρακτηριστικοί βιοδείκτες των Αρχαίων που εμπλέκονται στην ΑΟΜ καθώς και των Βακτηρίων που δρουν σε συντροφία με τα Αρχαία ανάγοντας θειικά. Ανιχνεύθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις sn-2,3-δι-O-ισοπρενοειδών γλυκερολαιθέρων (κυρίως αρχαιόλης και sn-2-υδροξυαρχαιόλης). Οι τιμές που μετρήθηκαν ήταν πολύ υψηλότερες (3 ως 12 φορές) για τα ιζήματα του Amsterdam σε σχέση με το Kazan. Στο υποθαλάσσιο ηφαίστειο ιλύος Amsterdam, το μέγιστο στην αφθονία των βιοδεικτών για τα Αρχαία παρατηρήθηκε στον ορίζοντα των 15 – 20 cmbsf (cm below sea floor, cm κάτω από την επιφάνεια του πυθμένα) και ο ορίζοντας αυτός συμπίπτει με τη ζώνη μετάβασης μεθανίου - θειικών. Στον πυρήνα από το υποθαλάσσιο ηφαίστειο Kazan δύο τοπικά μέγιστα παρατηρήθηκαν στους ορίζοντες 5-10 και 20-25 cmbsf, που αντιστοιχούν στην πρωταρχική ζώνη μετάβασης μεθανίου - θειικών στον ορίζοντα 7 με 13 cmbsf και σε μία δευτερεύουσα ζώνη μετάβασης στα 20 με 25 cmbsf. Χαρακτηριστικά λιπαρά οξέα, όπως τα C16:1ω7c και C18:1ω7c, έδειξαν κυριαρχία των θειιοξιδωτικών Βακτηρίων (SOx) στο επιφανειακό μισό των πυρήνων και για τα δύο ηφαίστεια. Ενδεικτικά λιπαρά οξέα για Βακτήρια που ανάγουν θειικά σε σύζευξη με την ΑΟΜ, όπως τα C16:1ω5c, cyC17:0ω5,6, aiC15 και iC15 ανιχνεύθηκαν επίσης σε σημαντικές ποσότητες. Η κατακόρυφη κατανομή των κοινοτήτων Αρχαίων και Βακτηρίων μελετήθηκε λεπτομερέστερα με την κατασκευή βιβλιοθηκών κλώνων του 16S rRNA γονιδίου. Η πλειονότητα των φυλοτύπων των Αρχαίων που βρέθηκαν και στα δύο ηφαίστεια ιλύος ανήκουν στα Euryarchaeota. Στο ηφαίστειο ιλύος Amsterdam, φυλότυποι που ανήκουν στα ΑΝΜΕ-1 φαίνεται να συνεπικρατούν με φυλοτύπους των ΑΝΜΕ-2 σε όλες τις βιβλιοθήκες κλώνων που κατασκευάστηκαν, εκτός από τον ορίζοντα των 30 cmbsf, όπου κυριαρχούν τα ΑΝΜΕ-3. Στις βιβλιοθήκες των Βακτηρίων επικράτησαν τα Proteobacteria (κυρίως τα υπόφυλα των γ-, δ- and ε- Proteobacteria) στους ορίζοντες ιζήματος 0 και 5 cmbsf. Φυλότυποι σχετιζόμενοι με το φύλο των Chloroflexi βρέθηκαν σε όλους τους ορίζοντες ιζήματος και επικράτησαν στα 10 cmbsf. Φυλότυποι που σχετίζονται με το υποψήφιο φύλο των JS1 ήταν επίσης παρόντες σε όλους τους ορίζοντες ιζήματος και κυριάρχησαν στα 15 cmbsf. Τα δ-Proteobacteria είχαν σημαντική αντιπροσώπευση σε όλες τις βιβλιοθήκες κλώνων και επέδειξαν τη μεγαλύτερη σχετική αφθονία στα 25 cmbsf. Γενικά, οι περισσότεροι από τους φυλοτύπους που ανιχνεύθηκαν σχετίστηκαν με φυλοτύπους από περιβάλλοντα πλούσια σε μεθάνιο, όπως ψυχρές αναβλύσεις και ιζήματα μεθανιούδριτών. Ανήκουν κυρίως σε πιθανούς θεεικοαναγωγικούς και θειοοξιδωτικούς οργανισμούς. Στο ηφαίστειο ιλύος Kazan η πλειονότητα των φυλοτύπων των Αρχαίων σχετίζονται με μη καλλιεργήσιμα μέλη των ΑΝΜΕ-2 από περιβάλλοντα όπου διενεργείται ΑΟΜ. Ανιχνεύθηκαν επίσης ομάδες των ΑΝΜΕ-1 και ΑΝΜΕ-3. Όσον αφορά τις βιβλιοθήκες κλώνων των Βακτηρίων, τα Proteobacteria ήταν το πιο άφθονο και ποικίλο φύλο, με τα γ-Proteobacteria να κυριαρχούν στον επιφανειακό ορίζοντα. Τα δ-proteobacteria περιλάμβαναν πολλούς από τους γνωστούς θειικοαναγωγικούς μικροοργανισμούς που λειτουργούν ως σύντροφοι των ΑΝΜΕ. Οι υπόλοιποι από τους φυλότυπους των Βακτηρίων ανήκουν σε 15 φύλα, με καλλιεργημένους ή όχι αντιπροσώπους και τρεις ομάδες μη σχετιζόμενες με γνωστά φύλα. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι φυλότυποι που βρέθηκαν αντιπροσωπεύουν μικροοργανισμούς από αντίστοιχα περιβάλλοντα. Η ποικιλότητα υπολογίστηκε με τη χρήση του δείκτη ποικιλότητας Shannon-Wiener (H) και το δείκτη ισοκατανομής Pielou (J). Ο δείκτης Shannon στον ίδιο ορίζοντα ιζήματος ήταν μικρότερος για τις βιοκοινότητες των Αρχαίων σε σχέση με αυτές των Βακτηρίων, αλλά δεν παρουσιάζουν το ίδιο πρότυπο μεταβολής με το βάθος για τις δύο επικράτειες. Η ανάλυση ομαδοποίησης, χρησιμοποιώντας το δείκτη Morisita για την κατασκευή μήτρας ομοιότητας, έδειξε ότι υπάρχουν περισσότερες ομοιότητες μεταξύ των βιοκοινοτήτων του ίδιου ηφαιστείου ιλύος. Ο βαθμός ομοιότητας των κοινοτήτων των Βακτηρίων, με εξαίρεση τους ορίζοντες 15 και 20 cmbsf και για τα δύο ηφαίστεια ιλύος, ήταν χαμηλός στο επίπεδο του φυλοτύπου, υποδεικνύοντας μικρή επικάλυψη μεταξύ των Βακτηριακών κοινοτήτων των διαφορετικών οριζόντων. Η παρουσία και η λειτουργική ποικιλότητα των Αρχαίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του μεθανίου (μεθανιότροφα και μεθανιογόνα Αρχαία) αναλύθηκε μέσω της ανίχνευσης και φυλογενετικής ανάλυσης του γονιδίου mcrA. Το γονίδιο mcrA κωδικοποιεί την υπομονάδα α της αναγωγάσης του μεθυλοσυνενζύμου Α, ενζύμου κλειδί τόσο για τη μεθανιογένεση όσο και για την αναερόβια οξίδωση του μεθανίου. Το γονίδιο mcrA ανιχνεύθηκε σε όλους τους ορίζοντες ιζήματος της θέσης του ηφαιστείου ιλύος Amsterdam και σε όλους, εκτός του επιφανειακού ορίζοντα ιζήματος, του Kazan. Πιθανοί παραγωγοί μεθανίου που σχετίζονται φυλογενετικά με το Methanogenium organophilum ανιχνεύθηκαν μόνο στο βαθύτερο ορίζοντα (30 cmbsf) και για τα δύο ηφαίστεια ιλύος. Οι υπόλοιποι φυλότυποι που βρέθηκαν ανήκουν στις φυλογενετικές ομάδες mcr a,b, mcr c, mcr e and mcr f. Γενικά, τα αποτελέσματα της ανάλυσης του γονιδίου mcrA είναι σε συμφωνία με τη φυλογενετική ανάλυση του 16S rRNA γονιδίου για το ηφαίστειο ιλύος Kazan. Στην περίπτωση του Amsterdam φαίνεται να υπάρχει αδυναμία στην ανίχνευση της ομάδας mcr a,b (που αντιστοιχεί στα ANME-1) για τους ορίζοντες ιζήματος 15 and 20 cmbsf. Η ΑΟΜ είναι σημαντική βιογεωχημική διεργασία στην πλειονότητα πλούσιων σε μεθάνιο ιζημάτων, όπως οι ψυχρές αναβλύσεις, όπως φαίνεται σε όλα τα δεδομένα από τα περιβάλλοντα αυτά, από την κατανομή των γεωχημικών και ιζηματολογικών στοιχείων μέχρι την παρουσία των επίπαγων ανθρακικού άλατος και των πλούσιων (χημειοσυνθετικών) βενθικών βιοκοινοτήτων. Στις θέσεις ιζήματος που μελετήθηκαν για τις ανάγκες της παρούσας εργασίας των ηφαιστείων ιλύος Amsterdam και Kazan όλες οι ενδείξεις, όπως οι κατανομές μεθανίου - θειικών, οι υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδιακών βιοδεικτών, οι φυλότυποι που ανιχνεύθηκαν, υποδεικνύουν ότι η ΑΟΜ είναι πιθανά ενεργή διεργασία σε αυτά τα ιζήματα. Διαφορές στο μέγεθος, τη συγκέντρωση και τη ροή του μεθανίου, τα ιζηματολογικά και γεωχημικά χαρακτηριστικά καθώς και το ιστορικό εκρήξεων μεταξύ των δύο ηφαιστείων ιλύος Amsterdam και Kazan (δύο ηφαιστείων που βρίσκονται στο ίδιο πεδίο ηφαιστείων και έχουν μικρή γεωγραφική απόσταση μεταξύ τους) είναι πιθανοί παράγοντες που έχουν ως αποτέλεσμα τη διαφοροποίηση των προκαρυωτικών κοινοτήτων σε αυτά. Επίσης, από την κατανομή των προτύπων βιοποικιλότητας και την ανάλυση ομαδοποίησης φαίνεται ότι για κάθε ένα από τα ηφαίστεια ιλύος η ηφαιστειακότητα (ιλύος) οδηγεί στη διαμόρφωση διαφορετικών βιοκοινοτήτων για κάθε επικράτεια. Το αποτύπωμα των λιπιδιακών βιοδεικτών και οι φυλότυποι που ανιχνεύθηκαν έδειξαν, ωστόσο, ότι και για τα δύο ηφαίστεια παρόμοιες ομάδες μικροοργανισμών κυριάρχησαν. Τα Αρχαία που βρέθηκαν, στην πλειονότητά του σχετίστηκαν με τις ομάδες των ΑΝΜΕ και τα Βακτήρια με πιθανούς θειικοαναγωγικούς, θειοοξιδωτικούς αλλά και ετερότροφους μικροοργανισμούς.