Νουκλεοσωμική οργάνωση και ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του χορίου μέσω ειδικών αρχιτεκτονικών παραγόντων στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori.

Abstract

The primary aim of this thesis was the characterization of protein factors that are implicated in the transcriptional regulation of middle chorion genes. This group of genes may be further divided into two subgroups bearing distinct (though overlapping) expression profiles: early-middle (the Α/B.L9 gene pair was chozen) and middle-late genes (A/B.L1). The promoter of either pair consists of the same protein binding modules but their architecture differs in the 200 bp sequence between the two TATA boxes. The main question, that therefore arizes, concerns intricate differences which ultimately lead to the temporal-specific activation and repression of these two groups of genes. Understanding this functional differentiation may shed light on questiond concerning gene expression regulation of metazoans, in general. Main focus of the thesis were the novel cDNA clones BmCHD1 and BmHMGA (GenBank acc. nos. DQ402511, DQ402512) and the in vitro characterized BmC/EBP clone. The first two are characterized as ‘architectural’ transcription factors due to their close, structural association with chromatin. The latter is a transcriptional regulator belonging to bZip superfamily. Characterization of these two clones was achieved via multiple alignments and generation of cladograms, as well as via in silico screenings of silkmoth EST and genomic sequence libraries. Their expression profiles (trancriptional and translational) were evidently correlated with choriogenic stages (mainly mid-choriogenesis). Functional characterization was pursued using fusion proteins produced and purified from bacteria. Bending assays showed that HMGA (but not CHD1) induces sharp bends on middle chorion gene promoters (of approx. 90o) as a result of binding using two consecutive AT-hook motifs and the acidic C-terminus. Deployment of protein-protein interaction was examined via Yeast-two-hybrid, co-immunoprecipitation and chemical cross-linking assays. These analyses revealed a sequence of events according to which HMGA acts as a ‘hub’ for regulating and alternating interaction with C/EBP, CHD1 and with the late-specific activator BmGATAβ. The functional characterization of HMGA, CHD1, C/EBP was concluded via antisense DNA interference assays. Results supported the participation of all three factors in the regulation of chorion genes, as well as of the C/EBP gene. Combining these assays with ChIP showed that C/EBP binding is directly dependent on previous HMGA binding, but also on CHD1-mediated chromatin remodeling, as C/EBP recognition elements are (pre-choriogenically) not accesible. CHD1 binding seems to be regulated by HMGA (DNA bending). Lastly, appending of H3K4me2/3 could not be realized in the absence of CHD1. In brief, initiating (and probably concluding) transcriptional cascades fo chorion genes depends on depolyment of differential protein-protein and protein-DNA interaction. CHD1 controls chromatin configuration, while C/EBP acts as both an activator and a repressor. HMGA mediates protein-protein interaction, coordinates the sequence of events and intercalates in the C/EBP-GATA1 functional equilibrium. HMGA-C/EBP-GATA-CHD1 relations seem to regulate expression of the C/EBP gene. Contortion of DNA stucture by HMGA should facilitate activation of both the α and the β-gene by a single promoter. The present thesis comments on cis-element architecture and interprotein relations for understanding the developmental regulation of chorion genes.

Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι ο χαρακτηρισμός πρωτεϊνικών παραγόντων που σχετίζονται με τη ρύθμιση των ενδιάμεσων γονιδίων του χορίου. Η ομάδα αυτή των γονιδίων μπορεί να διαιρεθεί σε δυο υποομάδες, με πιο εξειδικευμένο πρότυπο έκφρασης: στα πρώιμα-ενδιάμεσα (επιλέχθηκε το ζεύγος Α/B.L9) και τα ενδιάμεσα-όψιμα (A/B.L1). Η αρχιτεκτονική των υποκινητών τους βασίζεται στα ίδια δομικά στοιχεία (αλληλουχίες αναγνώρισης μεταγραφικών ρυθμιστών) διαφοροποιείται όμως η διάταξή τους κατά μήκος των 200 bp που περιλαμβάνονται ανάμεσα στις δυο αλληλουχίες ΤΑΤΑ. Στο επίκεντρο της μελέτης τοποθετήθηκαν οι νέοι cDNA κλώνοι BmCHD1 και BmHMGA (GenBank acc. nos. DQ402511, DQ402512) και ο χαρακτηρισμένος BmC/EBP. Οι δύο πρώτοι χαρακτηρίζονται ‘αρχιτεκτονικοί’ μεταγραφικοί παράγοντες εξαιτίας της δομικής σχέσης που δυνητικά αναπτύσσουν με τη χρωματίνη. Ο τελευταίος αποτελεί ένα γνωστό μεταγραφικό ρυθμιστή της υπεροικογένειας των πρωτεϊνών με φερμουάρ λευκίνης. Το πρότυπο έκφρασής τους εμφανίζει σαφή συσχέτιση με τη φάση της χοριογένεσης, όπως και με το πρότυπο έκφρασης του παράγοντα C/EBP. Παρατηρήθηκε (μέσω qRT-PCR) ότι τα γονίδια HMGA, CHD1 μεταγράφονται με υψηλούς ρυθμούς κατά τη βιτελλογένεση, την ενδιάμεση και την όψιμη χοριογένεση· μικρότερα επίπεδα εντοπίστηκαν κατά τα υπόλοιπα στάδια. Η παραγωγή των αντίστοιχων πρωτεϊνών φαίνεται, μέσω ανοσοστύπωσης (Western blot) να διατηρείται σταθερά σε υψηλά επίπεδα. Ακολούθησε μελέτη των βασικών λειτουργικών χαρακτηριστικών των δύο παραγόντων. Δοκιμές κάμψης του DNA έδειξαν ότι ο HMGA επάγει το σχηματισμό γωνιών στους ενδιάμεσους υποκινητές (90ο κατά μέση τιμή), αποτέλεσμα της συνεργιστικής δράσης δύο ‘AT-hook’ μοτίβων και της όξινης καρβοξυλικής ‘ουράς’ του μορίου. Η ανάπτυξη διαπρωτεϊνικών σχέσεων εξετάστηκε μέσω πειραματικών διατάξεων στο σύστημα ‘Δύο Υβριδίων’ (Yeast-two-hybrid), μέσω συν-ανοσοκατακρημνίσεων και μεθόδων in vitro ομοιοπολικης διασύνδεσης πρωτεϊνών. Το σύνολο των αναλύσεων αποκάλυψε μια αλληλουχία μοριακών γεγονότων: ο παράγοντας HMGA αποτελεί τον ‘κόμβο’ που ρυθμίζει και εναλλάσσει σχέσεις αλληλεπίδρασης με τους CHD1, C/EBP όπως και με τον ειδικό ενεργοποιητή των όψιμων γονιδίων, BmGATAβ. Οι CHD1, C/EBP δεν βρέθηκε ότι αλληλεπιδρούν και η δράση τους φαίνεται πως συντονίζεται μέσω της σχέσης τους με τον HMGA, όπως προσδιορίστηκε από πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης (ChIP) στους υποκινητές των γονιδιακών ζευγών A/B.L1, A/B.L9. H παρουσία του CHD1 συσχετίζεται με τη τροποποίηση (δι-/τριμεθυλίωση) της θέσης της λυσίνης 4 στην ιστόνη Η3 και με την αναδιοργάνωση της νουκλεοσωμικής διαρύθμισης. Βρέθηκε, δηλαδή, ότι μετακινεί ένα ιστονικό οκταμερές κατά 25 bp αριστερότερα, αποκαλύπτοντας σημαντικά cis-στοιχεία στο α-ήμισυ του υποκινητή L9. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των HMGA, CHD1, C/EBP συμπληρώθηκε από πειράματα παροδικής καταστολής της γονιδιακής έκφρασης μέσω παρεμβολής με τροποποιημένα μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια DNA (antisense DNA interference). Συνοπτικά, η εκκίνηση (και πιθανότατα η ολοκλήρωση) της μεταγραφής κατά τη χοριογένεση πραγματοποιείται μέσω διαφορικών πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων και αλληλεπιδράσεων DNA-πρωτεϊνών. Ο παράγοντας CHD1 οριοθετεί τις μετακινήσεις των νουκλεοσωμάτων, ενώ ο C/EBP δρα τόσο ενεργοποιητικά όσο και κατασταλτικά. Ο HMGA διαμεσολαβεί στην ανάπτυξη των διαπρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, συντονίζοντας και οργανώνοντας τη διαδοχή των μοριακών γεγονότων και παρεμβαίνει στο λειτουργικό ισοζύγιο C/EBP-GATA το οποίο φαίνεται να ρυθμίζει τη μετάβαση από την ενδιάμεση στην όψιμη χοριογένεση. Οι σχέσεις HMGA-C/EBP-GATA φαίνεται να συμμετέχουν σε ένα κλειστό μεταγραφικό κύκλωμα το οποίο ελέγχει τόσο τη ρύθμιση των γονιδίων του χορίου, όσο και του γονιδίου C/EBP.