Ανάπτυξη και εφαρμογή διαγνωστικών μεθόδων για τον προσδιορισμό και χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών που είναι υπεύθυνες για τις διάφορες εγκεφαλοπάθειες

Abstract

The conversion of a normal g;ycoprotein, prion protein (PrPC) to its abnormal isoform (PrPSc) seems to be the main factors underlying the pathogenesis of spongiform encephalopathies. There are many studies indicating that PrP interacts with glycosaminoglycans (GAGs) and we exploited this interaction to develop a sensitive solid phase assay for detection of both PrP isoforms. GAGs were immobilized by theis negative charge to ELISA plate wells activated by the sequential reaction of glutaraldehyde and spermine. Recombinant PrP and tissue homogenate extracted PrP were used for this study. In addition and taking into account that glycosylation of PrP is species specific, similarly activated ELISA plate wells were used to determine different PrP glycoforms. The most interesting outcome of the second part of the study is the differential binding of RCA to the normal and scrapie brain homogenates. DSL and WGA seems to bind almost equally to both samples, and all three have an increased sensitivity to PrPSc after proteinase K digestion.

Τα prions είναι ο μολυσματικός παράγοντας, πρωτεϊνικής φύσης, που προκαλεί μια κατηγορία θανατηφόρων νευροεκφυλιστικών ασθενειών μέσω ενός πρωτόγνωρου μηχανισμού. Οι πιο γνωστές ασθένειες της κατηγορίας αυτής είναι η Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) στα βοοειδή, η scrapie στα αιγοπρόβατα και η Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) στους ανθρώπους. Στις ασθένειες αυτές εμπλέκεται διαμορφωτική τροποποίηση της εν λόγω πρωτεΐνης. Αντικειμενικός σκοπός της διατριβής είναι η ανάπτυξη μεθοδολογίας, τόσο για τον εμπλουτισμό των βιολογικών δειγμάτων σε prion, όσο και για τον προσδιορισμό τους γρήγορα και αξιόπιστα, σε ιστούς που είναι εύκολα προσβάσιμοι, όπως είναι οι αμυγδαλές. Για τον λόγο αυτό, αναζητήθηκαν μόρια με τα οποία η συγκεκριμένη πρωτεΐνη αναφέρεται ότι αλληλεπιδρά και χρησιμοποιήθηκε η αλληλεπίδραση αυτή για τον προσδιορισμό της. Ανάμεσα στα μόρια αυτά είναι οι GAGs, για τις οποίες αναφέρεται ότι συμμετέχουν στον μηχανισμό μετατροπής της PrPC σε PrPSc. Για τη διεκπεραίωση της μελέτης αναπτύχθηκαν συστήματα σε στερεά φάση που έφεραν ακινητοποιημένες διάφορες GAGs και αφήνονταν προς αλληλεπίδραση με πρότυπο PrP, με ομογενοποιήματα διαφόρων ιστών, φυσιολογικών και παθολογικών. Τα συστήματα αυτά χρησιμοποιήθηκαν είτε για τον έλεγχο διαχωρισμού των δύο μορφών της PrP είτε για τον προσδιορισμό των δύο μορφών της.