Αξιοποίηση της γονιδιακής μεταγραφής και μετάφρασης σε προσδιορισμούς νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών

Abstract

The goals of this doctoral dissertation are: a) the exploitation of gene transcription and translation for molecular signal amplification in heterogeneous identification methods of biomolecules, b) the development of a rapid method for the preparation of recombinant photoproteins and their application as reporters in DNA hybridization assays and c) the comparative study of the bioluminescent reaction of aequorin and obelin triggered by Ca2+ and Tb3+ ions. The basic tools that were used are i) recombination DNA techniques and ii) DNA expression into protein through in vitro transcription and translation. In this dissertation was achieved molecular signal amplification because the signal received corresponds in more than one reporter molecules per target DNA hybrid. Bioluminescent reporters were produced in less than 3 hours compared to several days needed in the classical approach. Tb3+ ions are able to trigger the bioluminescent reaction of aequorin but not that of obelin, thus a dual-analyte assay of the two photoproteins can be performed

Στους στόχους της διδακτορικής διατριβής συγκαταλέγονται: α) η αξιοποίηση της γονιδιακής μεταγραφής και μετάφρασης για τη μοριακή ενίσχυση του σήματος σε ετερογενείς μεθόδους προσδιορισμού βιομορίων, β) η ανάπτυξη γενικής μεθόδου ταχείας παραγωγής ανασυνδυασμένων φωτοπρωτεϊνών και η εφαρμογή τους ως ιχνηθετών σε αναλύσεις υβριδοποίησης DNA και γ) η μελέτη της βιοφωταυγάζουσας αντίδρασης της ακουορίνης και της οβελίνης παρουσία ιόντων Ca2+ και Tb3+. Ως βασικά εργαλεία έχουν χρησιμοποιηθεί i) τεχνικές ανασυνδυασμού του DNA και ii) έκφραση του DNA σε πρωτεΐνη μέσω συζευγμένης μεταγραφής και μετάφρασης in vitro. Στη διατριβή αυτή επετεύχθη η μοριακή ενίσχυση του σήματος καθώς το ληφθέν σήμα αντιστοιχεί σε περισσότερα του ενός μόρια ιχνηθέτη ανά υβρίδιο προσδιοριζόμενου DNA-στόχου. Παρασκευάσθηκαν βιοφωταυγάζοντες ιχνηθέτες σε λιγότερο από 3 ώρες ενώ η κλασική μέθοδος απαιτεί πολλές ημέρες. Τα ιόντα Tb3+ πυροδοτούν την αντίδραση της ακουορίνης αλλά όχι της οβελίνης, οπότε μπορεί να γίνει διαφορικός προσδιορισμός των δύο φωτοπρωτεϊνών.