Οξειδωτικό στρές στη χρόνια νεφρική ανεπάρκεια

Abstract

Oxidative damage has been reported to be increased in uremic patients and thus has been suggested as a possible risk factor contributing to the pathogenesis of cardiovascular complications and the progression of chronic kidney disease (CKD). Although, several studies have evaluated the levels of oxidative stress in hemodialysis (HD) patients, little is known about the oxidative damage in predialysis and peritoneal dialysis (PD) patients. The aim of the present investigation was to evaluate the relative levels of systemic oxidative stress in predialysis, hemodialysis and peritoneal dialysis patients, as indicated by the oxidative modifications in plasma proteins and the DNA damage of lymphocytes. Plasma samples from 20 apparently healthy control individuals and 127 CKD patients were evaluated, by Western blot analysis, for the estimation of the levels of protein nitration and carbonyl formation. Patients were divided in 5 groups: CKD patients of stages 2, 3 and 4, according to the severity of the disease, HD and PD patients. Also, immunoprecipitation of plasma proteins of HD patients by antinitrotyrosine-agarose conjugated antibodies, followed by Western blotting, was used in an attempt to identify the nitrated proteins. Finally, the DNA damage of lymphocytes of HD patients was evaluated by comet assay technique. Although several proteins with nitrated tyrosine residues were observed in plasma of healthy individuals, increased nitration levels were observed in some specific proteins in all HD patients tested compared with controls (p<0.001). At least 6 apparent bands appeared to be more nitrated than their counterparts in plasma from controls. Although protein nitration was also higher in predialysis and PD patients, the difference did not reached significance. Albumin represented the main plasma carbonylated protein. Increasing carbonylation of albumin was detected along with the severity of chronic kidney disease, reaching significance at stages 3 and 4 (p<0.01) compared to healthy controls). The carbonylation of albumin was even higher in the plasma of HD patients (p<0.001), while in PD patients it was not statistically significant compared to controls. Ceruloplasmin was identified as one of the proteins which was significantly increased in HD patients compared to healthy controls (p<0.01). The data presented in this work indicate that oxidative stress in CKD patients is gradually increased during the development of the disease. This stress was intensified during HD, but it was less in PD subjects, suggesting that this method is, perhaps, a more biocompatible dialysis technique.

Ο συνεχώς αυξανόμενος αριθμός των ασθενών με ΧΝΝ αλλά και οι σημαντικές μακροπρόθεσμες επιπλοκές της νόσου, με κυριότερη την καρδιαγγειακή νοσηρότητα, έχουν καταστήσει επιτακτική την ανάγκη της πολυπαραγοντικής προσέγγισης και αντιμετώπισης της νόσου. Τα τελευταία χρόνια, μεταξύ των άλλων παραγόντων κινδύνου, αναγνωρίστηκε και ο σημαντικός ρόλος του οξειδωτικού στρες, τόσο στην εγκατάσταση και εξέλιξη της ΧΝΝ, όσο και στην εμφάνιση των επιπλοκών της. Οι περισσότερες μελέτες, έως τώρα, αφορούσαν ασθενείς που ήδη υποβάλλονταν σε μια από τις μεθόδους υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας και κυρίως σε ΑΚΘ. Λίγα δεδομένα, όμως, είναι γνωστά σχετικά με το πόσο νωρίς αρχίζει το οξειδωτικό στρες στην εξέλιξη της νόσου. Το γεγονός, μάλιστα, ότι υπάρχουν μελέτες που αναφέρουν ότι ο καρδιαγγειακός κίνδυνος στους ασθενείς αυτούς είναι αυξημένος από πολύ νωρίς στην εξέλιξη της νόσου, κάνει επιτακτική την ανάγκη πιο ενδελεχούς προσέγγισης αυτών των ασθενών. Σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν να προσδιοριστούν τα επίπεδα του οξειδωτικού στρες τόσο στους ασθενείς με ΧΝΝ και διαφόρου βαθμού έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας, όσο και στους ασθενείς που υποβάλλονται σε εξωνεφρική κάθαρση, είτε με ΑΜΚ είτε με ΠΚ. Το ενδιαφέρον, επίσης, εστιάστηκε, στη σύγκριση των δύο μεθόδων υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας, όσον αφορά τα επίπεδα του οξειδωτικού στρες. Εκατόν είκοσι επτά ασθενείς με ΧΝΝ που ταξινομήθηκαν σε 5 ομάδες (ασθενείς με ΧΝΝ σταδίων 2, 3 και 4, ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΑΚΘ και ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΠΚ) και 20 υγιείς μάρτυρες μελετήθηκαν για τα επίπεδα της νίτρωσης και της καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών του πλάσματος. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ανοσοαποτύπωσης με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων δέσμευσης των νιτροτυροσινών και των καρβονυλίων. Έγινε, επίσης, προσπάθεια ταυτοποίησης των πρωτεϊνών του πλάσματος των αιμοκαθαιρόμενων ασθενών που υφίστανται νίτρωση με τη βοήθεια της μεθόδου της ανοσοκαθίζησης και τη χρήση ειδικού αντισώματος έναντι νιτροτυροσινών, συνδεδεμένο με αγαρόζη. Ακολούθησε η μέθοδος της ανοσοαποτύπωσης με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι συγκεκριμένων πρωτεϊνών (της σερουλοπλασμίνης, της αλβουμίνης και της τρανσφερίνης). Τέλος εκτιμήθηκε το ποσοστό βλάβης του DNA των λεμφοκυττάρων των ασθενών που υποβάλλονταν σε ΑΚΘ με τη μέθοδο comet assay. Σημαντικά αυξημένα επίπεδα νιτροτυροσινών (p<0.001), διαπιστώθηκαν στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες και για όλες τις πρωτεΐνες που μελετήθηκαν (και που αντιστοιχούσαν στα MB των 156, 110, 79, 67, και 49 kD), πλην της πρωτεΐνης που αντιστοιχούσε στο MB των 29 kD. Οι ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΠΚ, όπως και οι ασθενείς με ΧΝΝ σταδίων 2, 3 και 4, παρόλο που είχαν αυξημένα επίπεδα νιτροτυροσινών, σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες, η αύξηση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική για καμία από τις πρωτεΐνες που εξετάστηκαν. Η καρβονυλίωση της αλβουμίνης, τόσο των αιμοκαθαιρόμενων ασθενών, όσο και των ασθενών με σταδίου 3 και 4 ΧΝΝ ήταν στατιστικά σημαντική, σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (p<0.001, p<0.01, p<0.01 αντίστοιχα). Ωστόσο, στους ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΠΚ, αν και η καρβονυλίωση της αλβουμίνης ήταν μεγαλύτερη από αυτή των υγιών μαρτύρων, αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Η σερουλοπλασμίνη διαπιστώθηκε να είναι η κύρια πρωτεΐνη που υφίσταται νίτρωση στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς, σε σημαντικό μάλιστα βαθμό σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (p<0.05). Η αλβουμίνη ανιχεύτηκε ανάμεσα στις πρωτεΐνες που υφίστανται νίτρωση, χωρίς όμως ο βαθμός αυτής να διαφέρει στατιστικά σημαντικά από τα υγιή άτομα. Όσον αφορά την τρανσφερίνη δεν κατέστη δυνατό να ανιχνευτεί ανάμεσα στις νιτροτυροσίνες που απομονώθηκαν με τη μέθοδο της ανοσοκαθίζησης, ούτε στα δείγματα των αιμοκαθαιρόμενων ασθενών ούτε και των υγιών ατόμων. Τέλος σημαντικό ποσοστό σχάσεων του DNA των λεμφοκυττάρων διαπιστώθηκε στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς (p<0.01) σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Παρόλο που το ποσοστό αυτό της βλάβης φάνηκε να μειώνεται μετά την ΑΚΘ, αυτή η μείωση δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Συμπερασματικά φαίνεται ότι το οξειδωτικό στρες εμφανίζεται νωρίς στην εξέλιξη της ΧΝΝ και επιτείνεται με την ένταξη του ασθενούς στην ΑΚΘ, όχι όμως και στην ΠΚ. Έτσι η ΠΚ, πιθανά, αποτελεί πιο ‘βιοσυμβατή’ μέθοδο υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας σε σύγκριση με την ΑΚΘ. Επίσης, ο προσδιορισμός των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών φαίνεται να αποτελεί μια πιο ακριβή μέθοδο εκτίμησης του οξειδωτικού στρες στη ΧΝΝ σε σύγκριση με τον προσδιορισμό των νιτροτυροσινών, αφού οι πολλαπλοί, πολύπλοκοι μηχανισμοί δράσης του NO , πιθανά, δεν παρέχουν τη δυνατότητα νίτρωσης των πρωτεϊνών σε τέτοιο βαθμό που να αντιστοιχεί στα επίπεδα αύξησης του οξειδωτικού στρες.