Τροποποίηση των υποστρωμάτων της in vitro παραγωγής εμβρύων βοοειδών με την προσθήκη παραγόντων του πρωτεολυτικού ενζυμικού συστήματος ενεργοποιοί του πλασμινογόνου - πλασμίνη

Abstract

It is generally accepted that the in vitro embryo production (IVP) protocols are still far from ideal. The development of optimal conditions for IVP has been a step upon step procedure. The understanding of the mechanisms governing basic biological processes is necessary in this procedure. Plasminogen is an extracellular proenzyme, abundant in blood plasma and most extacellular fluids. Plasminogen activators (PAs) are proteolytic enzymes, capable of converting plasminogen into the broad-spectrum, trypsin-like proteinase, plasmin. The precise temporal and spatial regulation of plasminogen activator(s) or plasmin activity is controlled by plasminogen activator inhibitors and plasmin inhibitors, respectively. In many animal species and the bovine, members of the plasminogen activators/plasmin system or their activity have been shown in follicular fluid, cumulus-oocyte complexes (COCs), oocytes, and cumulus-cell cultures. Plasminogen activators and other members of the plasmin proteolytic system or their activity have been also shown in oviduct, in whole sperm extracts and in sperm plasma and outer acrosomal membrane extracts. Members of the plasmin system or their activity have been found in embryos from the zygote until the hatched blastocyst stage. Extracellullar proteolysis, linked with plasminogen activator/plasmin system activity, is probably implicated in physiological processes, such as cumulus-cell layer expansion, oocyte maturation, fertilization, zona reaction and embryo implantation. These findings provide evidence for a role of plasmin system in reproduction. Considering that in vitro embryo production (IVP) media emulate, to a degree, the in vivo conditions, the plasminogen activator/plasmin system presence and/or activity in the IVP procedure is possibly a factor that could affect IVP outcome. The aim of the present study was to examine the role of addition of urokinase plasminogen activator (u-PA), tissue type plasminogen activator (t-PA), plasmin or plasmin inhibitor (ε-ACA) into the different stages of bovine IVP procedure. In the first part of this study plasminogen activator activity, plasminogen activator inhibition and plasmin inhibition in preovulatory and mid-cycle dominant follicle follicular fluid, as well as in in vitro maturation, fertilization and embryo culture media were determined. In follicular fluid samples PAs activity was identified. In the second part of this study four major categories of experiments using 10.639 COCs were conducted. In the first one in vitro maturation medium was modified by addition of plasminogen (5 CU/0.1ml), u-PA (0.5 IU/0.1ml), t-PA (50 IU/0.1ml), plasmin (5 CU/0.1ml plasminogen + 1 IU/0.1ml u-PA and preincubation for 30 min) or ε-ACA (10 mM). After 18 or 24 hour incubation, oocytes were fixed and stained, in order to estimate the effect of IVM medium modification on nuclear maturation. In the second category after 18 or 24 hour incubation, as above, the oocytes underwent IVF and IVC, in order to estimate the effect of IVM medium modification on cytoplasmic maturation. In the third category, IVF medium was modified by addition of plasminogen (5 CU/0.1ml), u-PA (0.5 IU/0.1ml), t-PA (50 IU/0.1ml), plasmin (5 CU/0.1ml plasminogen + 1 IU/0.1ml u-PA and preincubation for 30 min) or ε-ACA (10 mM). After 24 hour incubation in the IVF medium, presumptive embryos were transferred in control IVC medium and 48 hour later incubation was terminated, in order to estimate the effect of IVF medium modification on fertilization and subsequent embryo development. In the fourth category IVC medium was modified by the addition of plasminogen (5 CU/0.1ml), u-PA (0.5 IU/0.1ml), t-PA (50 IU/0.1ml), plasmin (5 CU/0.1ml plasminogen + 1 IU/0.1ml u-PA and preincubation for 30 min) or ε-ACA (10 mM). After 24h incubation in controls IVM and IVF media presumptive embryos were transferred in the modified IVC medium. The estimation of embryo development was made at 48h of incubation. In each experiment, one standarized medium served as control, while a second plasminogen-supplemented medium was also included. The modification of the media was performed only to one phase of IVP each time. Our results are as follows: 1) a. PAA of preovulatory and mid-cycle dominant follicle follicular fluid was significantly higher compared to PAA detected in IVM, IVF and IVC media. PAI and PI of preovulatory and mid-cycle dominant follicle follicular fluid were significantly higher compared to PAI and PI detected in IVM, IVF and IVC media. b. PAA and PAI of the follicular fluid of preovulatory follicle were significantly higher compared to PAA and PAI of mid-cycle dominant follicle follicular fluid. c. In follicular fluid samples both plasminogen activators were identified

Η εφαρμογή in vitro τεχνικών στην αναπαραγωγή των αγροτικών ζώων και, ειδικότερα, η in vitro παραγωγή εμβρύων βοοειδών παρέχει τη δυνατότητα εντατικής αξιοποίησης ζώων υψηλών αποδόσεων, καθώς και επιτάχυνσης του ρυθμού γενετικής βελτίωσης. Όμως, οι τελικές αποδόσεις σε έμβρυα ικανά να μεταφερθούν σε ζώα-δέκτες, βρίσκονται σε χαμηλά επίπεδα, γεγονός που επιβαρύνει το τελικό κόστος ανά έμβρυο. Σήμερα, οι σημαντικότεροι στόχοι στο επίπεδο της παραγωγής εμβρύων βοοειδών είναι η μείωση της χρονικής διάρκειας εκτέλεσης των in vitro τεχνικών, με ταυτόχρονη βελτίωση της ποσότητας και ποιότητας των παραγόμενων εμβρύων. Στην in vitro παραγωγή εμβρύων, για τους χειρισμούς των γαμετών και των παραγόμενων εμβρύων χρησιμοποιούνται υγρά υποστρώματα. Η σύνθεση των υποστρωμάτων αυτών μιμείται, κατά το δυνατόν, τη σύνθεση των βιολογικών τους αντίστοιχων, δηλαδή του ωοθυλακικού υγρού, του υγρού του ωαγωγού και του περιβάλλοντος της μήτρας. Οι μειωμένες αποδόσεις της in vitro παραγωγής εμβρύων αποδίδονται, σε μεγάλο βαθμό, στη σύνθεση αυτών των υποστρωμάτων. Διεθνώς, επιχειρείται βελτίωση του ποσοστού απόδοσης των τεχνικών με τροποποιήσεις της σύνθεσης των υποστρωμάτων. Στις προσπάθειες αυτές δεν έχει διερευνηθεί πλήρως ο πιθανός ρόλος του ενζυμικού συστήματος «ενεργοποιοί του πλασμινογόνου-πλασμίνη», που συμμετέχει, in vivo, στη διαμόρφωση του περιβάλλοντος του ωαρίου, της γονιμοποίησης και του εμβρύου. Αυτό έχει ως πιθανό αποτέλεσμα τυχαίες παρεμβάσεις, σε σχέση με το ενζυμικό σύστημα, στο περιβάλλον των γαμετών και των εμβρύων. Δραστηριότητα του συστήματος «ενεργοποιοί του πλασμινογόνου-πλασμίνη» έχει ανιχνευθεί στην ωοθήκη, στα ωοθυλάκια, στα κοκκώδη κύτταρα, στο ωάριο, στον ωαγωγό, στο σπέρμα, στο έμβρυο και στη μήτρα των βοοειδών. Το σύστημα αυτό φαίνεται ότι συμμετέχει στην ανάπτυξη του ωοθυλακίου, στην ωρίμανση των γαμετών, στη γονιμοποίηση, στην αντίδραση της διαφανούς ζώνης, στην ανάπτυξη του εμβρύου και στην εγκατάστασή του στη μήτρα.