Συμβολή της γενετικής και βιοτεχνολογίας στην κατανόηση της αποφρακτικής νόσου των αεραγωγών

Abstract

Previous studies have shown that microsatellite (MS) DNA instability (MSI) is detectable in sputum cells in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma. The aim of the present study was to investigate whether asthma and COPD could be distinguished at the MS DNA level. DNA was extracted from sputum cells and white blood cells from 63 COPD patients, 60 non-COPD smokers, 36 asthmatics and 30 healthy non-smokers. Ten MS markers located on chromosomes 2p, 5q, 6p, 10q, 13q, 14q and 17q were analysed. No MSI was detected in non-COPD smokers or healthy nonsmokers. A significantly higher proportion of COPD patients exhibited MSI (49.2%) compared to asthmatics (22.2%). MSI was detected even in the mild stages of COPD (33.3%) and asthma (22.2%). No relationship was found between MSI and COPD severity. The most frequently affected marker was D14S588 (17.5% in COPD and 2.7% in asthma). The markers D6S344, G29802 and D13S71 showed alterations only in COPD, and G29802 was associated with a significantly decreased forced expiratory volume in one second FEV1 (% predicted), whereas MSI in D6S344 was associated with a significantly higher FEV1 (% pred). The frequency of microsatellite instability was higher in chronic obstructive pulmonary disease than in asthma, and microsatellite instability in three workers showed chronic obstructive pulmonary disease specificity. However, further studies are needed to verify the differences between chronic obstructive pulmonary disease and asthma at the microsatellite level.

Σκοπό της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η σύγκριση του Μικροδορυφορικού προτύπου ασθενών με ΧΑΠ έναντι ασθενών με Βρογχικό Άσθμα. Ως πρώτο βήμα για τη διερεύνηση της κοινής ή μη κοινής γενετικής βάσης των δύο ασθενειών, χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης η συχνότητα εμφάνισης των φαινομένων της Αστάθειας των αλληλουχιών του Μικροδορυφορικού DNA (Μicrosatellite DNA Instability, MSI). H αστάθεια των μικροδορυφορικών DNA αλληλουχιών, όπως έχει δειχθεί απόπροηγούμενες μελέτες (Siafakas et al, 1999, Spandidos et al, 1996, Paraskakis et al, 2003), σε ασθενείς ΧΑΠ και Άσθματος, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης γενετικής ευαισθησίας, αναδεικνύοντας αποσταθεροποίηση του γονιδιώματος που θα μπορούσε να επηρεάσει άλλα γονίδια, οδηγώντας έτσι στην απορρύθμιση των κυττάρων που υφίστανται τις παραπάνω μεταλλαγές. Με την παρούσα μελέτη, στοχεύσαμε στην ανάδειξη νέων πληροφοριών της μοριακής παθογένειας της χρόνιας αποφρακτικής νόσου των αεραγωγών, μελετώντας εξειδικευμένους μικροδορυφορικούς σημαντές στα δύο νοσήματα προσεγγίζοντας συγκεκριμένες χρωμοσωμικές περιοχές που έχουν εμπλακεί μέχρι τώρα στην παθογένεια της ΧΑΠ και του Άσθματος. Για την πραγματοποίηση της μελέτης επιλέχθηκαν ασθενείς με Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (Χ.Α.Π.) και Άσθμα. Τα δείγματα (πτύελα και περιφερικό αίμα), ελήφθησαν από τους ασθενείς της Πνευμονολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου, Ηρακλείου Κρήτης, αφού πρώτα δόθηκε έγκριση από την Επιτροπή Ιατρικής Έρευνας και Ηθικής, του Νοσοκομείου. Μελετήθηκαν συνολικά 189 δείγματα. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκαν δείγματα από 63 ασθενείς με Χ.Α.Π., 60 καπνιστές που δεν έπασχαν από Χ.Α.Π., 36 ασθενείς με Άσθμα και 30 υγιή άτομα. Η ομάδα των ασθενών με Άσθμα καθώς και η ομάδα των υγιών ατόμων περιελάμβανε μη καπνιστές. Εκχυλίστηκε DNA τόσο από τα κύτταρα πτυέλου και από τα λευκοκύτταρα του περιφερικού αίματος, χρησιμοποιώντας καθορισμένα πρωτόκολλα (QIAamp DNA Blood Maxi Kit, Qiagen Inc. και QIAamp DNA Mini kit, Qiagen Inc.). Βελτιστοποιήθηκε ο σχεδιασμός των άριστων συνθηκών για PCR ανάλυση, για τους μικροδορυφορικούς δείκτες που μελετήθηκαν: G29802, RH70958, D17S250, D5S207, D13S71, D14S588, D14S292, D6S2223, D6S263, D6S344. Η επιλογή των συγκεκριμένων χρωμοσωμικών περιοχών στηρίχτηκε σε προηγούμενες μελέτες οι οποίες περιγράφουν τις περιοχές αυτές ως περιέχουσες υποψήφια γονίδια για την ΧΑΠ και το Άσθμα. Από τα αποτελέσματα της παρούσας ερευνητικής μελέτης αναδεικνύονται τρεις μικροδορυφορικοί δείκτες, οι G29802, D13S71 και D6S344, ως ειδικοί μόνο για την Χ.Α.Π και όχι για το Άσθμα. Τα δείγματα που ελήφθησαν από την ομάδα των καπνιστών που δεν έπασχαν από Χ.Α.Π. καθώς και από την ομάδα των υγιών ατόμων, δεν ανέδειξαν το φαινόμενο της Μικροδορυφορικής Αστάθειας σε κανέναν από τους δέκα Μικροδορυφορικούς Δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Η αναλογία των ασθενών με Χ.Α.Π. που εμφάνισαν Μικροδορυφορική Αστάθεια στα δείγματα πτυέλου, ήταν σημαντικά υψηλότερη συγκρινόμενη με την αντίστοιχη αναλογία των ασθενών με Άσθμα (31 (49,2 %) έναντι 8 (22,2%) ασθενών με Άσθμα (p=0.01; Chi-squared test)). Το φαινόμενο της Μικροδορυφορικής Αστάθειας ανιχνεύτηκε σε περισσότερους του ενός Μικροδορυφορικούς Δείκτες στο ίδιο άτομο (50 περιπτώσεις MSI σε 31 ασθενείς με Χ.Α.Π.). Πιο αναλυτικά, 23 ασθενείς με Χ.Α.Π. ανέδειξαν Μικροδορυφορική Αστάθεια σε ένα Μικροδορυφορικό Δείκτη, τέσσερις ασθενείς σε δύο Μικροδορυφορικούς Δείκτες και τέσσερις σε περισσότερους των τριών Μικροδορυφορικών Δεικτών. Εκτός από έναν ασθενή με Άσθμα που ανέδειξε Μικροδορυφορική Αστάθεια σε δύο Μικροδορυφορικούς Δείκτες, όλοι οι υπόλοιποι (επτά ασθενείς) εμφάνισαν Μικροδορυφορική Αστάθεια σε έναν Μικροδορυφορικό Δείκτη. Ο Μικροδορυφορικός Δείκτης που ανέδειξε τα υψηλότερα ποσοστά Μικροδορυφορικής Αστάθειας και στις δύο ομάδες (Χ.Α.Π. και Άσθμα), είναι ο D14S588 (17,5% στην Χ.Α.Π. και 2,7% στο Άσθμα (p=0.06; Yates-corrected Chi-squared test). Οι Μικροδορυφορικοί Δείκτες G29802, D13S71 και D6S344 ανέδειξαν Μικροδορυφορική Αστάθεια μόνο στην ομάδα της Χ.Α.Π., ενώ ο Δείκτης D6S2223 ανέδειξε Μικροδορυφορική Αστάθεια μόνο σε έναν ασθενή με Χ.Α.Π. και σε κανέναν ασθενή με Άσθμα. Κανένας Μικροδορυφορικός Δείκτης δεν ανέδειξε ειδικότητα για το Άσθμα. Το φαινόμενο της Μικροδορυφορικής Αστάθειας ανιχνεύτηκε ακόμα και στην υποομάδα της ήπιας μορφής Χ.Α.Π. (33,3%). Η βαρύτητα της νόσου δεν φάνηκε να σχετίζεται με την συχνότητα της Μικροδορυφορικής Αστάθειας, εφόσον δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα ποσοστά των ασθενών που εμφάνισαν Μικροδορυφορική Αστάθεια στις τέσσερις υποομάδες της Χ.Α.Π. (Ήπια, Μέτρια, Βαρειά και πολύ Βαρειά Χ.Α.Π.) που μελετήθηκαν (Chi-squared test). Παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της τιμής FEV1 (% του προβλεπόμενου) μεταξύ των ασθενών με Χ.Α.Π. που εμφάνισαν Μικροδορυφορική Αστάθεια στον Μικροδορυφορικό Δείκτη G29802 (Mann-Whitney test) ενώ η εμφάνιση Μικροδορυφορικής Αστάθειας στον Μικροδορυφορικό Δείκτη συσχετίστηκε με αυξημένη τιμή FEV1 (% του προβλεπόμενου, p=0.01). Μη στατιστικά σημαντική διαφορά στις τιμές FEV1 (% του προβλεπόμενου) ανιχνεύτηκε μεταξύ των ασθενών με Χ.Α.Π. που εμφάνισαν και των ασθενών με Χ.Α.Π που δεν εμφάνισαν Μικροδορυφορική Αστάθεια στον Μικροδορυφορικό Δείκτη D13S71 (p=0.5; Mann-Whitney test). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι ποσοστό 49,2 % των ασθενών με Χ.Α.Π. και 22,2 % των ασθενών με Άσθμα ανέδειξαν Μικροδορυφορική Αστάθεια (p=0.01). Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν ένα διαφορετικό πρότυπο, σε επίπεδο Μικροδορυφορικής Αστάθειας, των δύο νόσων. Επιπρόσθετες μελέτες απαιτούνται για την εκτενέστερη μελέτη των διαφορών ανάμεσα στην Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια και το Άσθμα σε επίπεδο Μικροδορυφορικού DNA.