Μελέτη του γονιδίου PRAME (εκλεκτικά εκφραζόμενου αντιγόνου μελανώματος) και του γονιδίου WT1 (Wilms' Tumour 1) σε αιματολογικές κακοήθειες της παιδικής ηλικίας

Abstract

PRAME gene was initially isolated as human melanoma antigen, identified by cytotoxic T-cells. This gene is found to be expressed at low levels in normal tissues, while increased PRAME expression has been reported in solid tumours and haematological malignancies. WT1 gene was firstly identified in a patient with Wilms’ tumour. It is expressed at low levels in normal bone marrow and peripheral blood and it has also been found at high levels in almost all adult haematological malignancies. The expression of the above mentioned genes has been inadequately studied in childhood acute leukaemia. The aim of this study is the quantitative evaluation of PRAME and WT1 expression in bone marrow samples from newly diagnosed children with acute leukaemia with the use of RT-PCR. It is also aimed to correlate these genes expression with known prognostic factors as well as with the outcome of the disease. Bone marrow blasts from 17 children with acute leukaemia (11 ALL, 4 AML, 1 AML secondary to MDS, 1 ALL at relapse) were studied at diagnosis. Bone marrow samples from seven children with non-malignant haematological diseases or solid tumours without bone marrow infiltration were used as control group. In addition, K562 cell line was the positive control. Total RNA was isolated from bone marrow samples and reverse transcription and RT- PCR were performed. PRAME expression was calculated relatively to K562 values. WT1 values obtained were normalized with respect to the number of ABL transcripts. PRAME levels were found undetectable or extremely low in the control group. The mean PRAME relative expression detected in the control group was 0.11±0.06x10⁻⁴ (range 0-0.46x10⁻⁴). Samples were considered positive for PRAME expression if their expression level was one log higher than the mean level of expression reported for the control group. The quantitative assessment in the whole group of children with acute leukaemia at diagnosis or relapse showed a mean relative PRAME expression of 7.57±4.04x10⁻⁴ (range 0-67.2x10⁻⁴). Nine (3 AML, 6 ALL) of the 17 patients (52.9%) expressed high levels of PRAME [mean 14.3±2.9x10⁻⁴ (range 1.12-67.2x10⁻⁴)]. PRAME expression levels in the whole group of children with acute leukaemia compared to the PRAME positive patients, as well as between PRAME positive and PRAME negative patients were found to be statistically significant (p=0.049, p=0.0001, respectively). WT1 levels were found to be extremely low or undetectable in the control group. The mean number of WT1 copies/10⁴ ABL copies detected in the control group was 80.2±25.6 (range 0.1-178). Samples were considered WT1 positive if their expression level was one log higher than the mean number of WT1 copies/104 ABL copies of the control group. K562 cell line had high WT1 expression levels (7896 WT1 copies/10⁴ ABL copies). The expression of WT1 in 14 children with acute leukaemia at diagnosis was analyzed. The quantitative assessment in the whole group of patients with acute leukaemia reported a mean WT1 copy number of 1559.71±810.11 WT1 copies/10⁴ ABL copies (range 15-10542). Five (2 ALL, 3 AML) of the 14 patients (35.7%) expressed high levels of WT1 with a mean number of 4250±1776.41 WT1 copies/10⁴ ABL copies (range 977-10542). WT1 expression levels in WT1 positive patients compared to controls as well as in WT1 positive and WT1 negative patients were found to be statistically significant (p=0.03, p=0.01 respectively). Significant amounts of PRAME mRNA were reported for the 52.9% of children with acute leukaemia at diagnosis studied. No important correlation could be found between PRAME expression and clinical characteristics such as age, sex, initial white blood cell count, response to therapy, or progression free and overall survival. In this study, WT1 expression in control bone marrow samples was found to be at low levels. It was shown that significant levels of WT1 are expressed in 35.7% of children with newly diagnosed acute leukaemia. All but one of the WT1 positive patients had an unfavourable clinical outcome. The majority of the WT1 negative patients has achieved complete remission. Six out of the nine (66%) patients that have been reported as WT1 negative were found to be PRAME positive. Respectively, two out of the five WT1 positive patients had undetectable PRAME mRNA levels. The fact that the two genes are not co-expressed in the same patient, points towards a possible combination of PRAME and WT1 in order to better detect pending relapses. In this study, overexpression of PRAME and WT1 was detected in a significant percentage of children with acute leukaemia at diagnosis, indicating that these genes could be used as molecular markers in childhood acute leukaemia.

Το γονίδιο PRAME εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε φυσιολογικούς ιστούς, ενώ έχει αναφερθεί αυξημένη έκφραση PRAME σε συμπαγείς όγκους, και αιματολογικές κακοήθειες ενηλίκων. Το γονίδιο WT1 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στο φυσιολογικό μυελό των οστών και στο περιφερικό αίμα και έχουν προσδιορισθεί υψηλά επίπεδα σε πολλές αιματολογικές κακοήθειες. Η έκφραση των παραπάνω γονιδίων στην οξεία λευχαιμία της παιδικής ηλικίας έχει μελετηθεί ελάχιστα. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης του PRAME και WT1 στο μυελό των οστών παιδιών στη διάγνωση της οξείας λευχαιμίας με τη χρήση RT-PCR και η συσχέτιση της έκφρασης των συγκεκριμένων γονιδίων με καθιερωμένους προγνωστικούς παράγοντες και την κλινική έκβαση της νόσου. Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών από 17 παιδιά στην διάγνωση ή υποτροπή οξείας λευχαιμίας (ΟΛΛ, ΟΜΛ). Σαν ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα μυελού οστών από παιδιά με μη κακοήθη αιματολογικά νοσήματα ή συμπαγείς όγκους χωρίς διήθηση μυελού των οστών. Χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας η κυτταρική σειρά Κ562. Απομονώθηκε ολικό RNA από δείγματα μυελού των οστών με εφαρμογή πρότυπου πρωτοκόλλου για δείγματα συντηρημένα στους -80°C. Ακολούθησε αντίστροφη μεταγραφή και μελέτη της έκφρασης των δύο γονιδίων με RT-PCR. Η σχετική έκφραση του PRAME υπολογίσθηκε με βάση τις τιμές για την Κ562, ενώ οι τιμές του WT1 εκφράζονται σε σχέση με αντίγραφα του ABL γονιδίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης PRAME κυμαίνονταν από μη ανιχνεύσιμα έως πολύ χαμηλά στην ομάδα ελέγχου. Η μέση τιμή της σχετικής έκφρασης του PRAME ήταν 0.11.±0.06x10⁻⁴ (εύρος 0- 0.46x10⁻⁴). Τα δείγματα θεωρήθηκαν θετικά για το γονίδιο PRAME αν η έκφρασή τους ήταν μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερη από τη μέση τιμή της αντίστοιχης έκφρασης της ομάδας ελέγχου. Η σχετική έκφραση του PRAME στο σύνολο της ομάδας των ασθενών ανέδειξε μία μέση τιμή 7.57±4.04x10⁻⁴ (εύρος 0-67.2x10⁻⁴). Υψηλά επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν στο 52.9% των ασθενών (3 ΟΜΛ, 6 ΟΛΛ) και η μέση τιμή της σχετικής έκφρασης του PRAME στη συγκεκριμένη υποομάδα των ασθενών ήταν 14.3±2.9x10⁻⁴ (εύρος 1.12-67.2x10⁻⁴). Η διαφορά στην έκφραση του PRAME ήταν στατιστικά σημαντική μεταξύ των PRAME θετικών ασθενών και του συνόλου της ομάδας των ασθενών (p=0.049) και ανάμεσα στους PRAME θετικούς και στους PRAME αρνητικούς ασθενείς (p=0.00). Τα επίπεδα έκφρασης του WT1 κυμαίνονταν από μη ανιχνεύσιμα έως πολύ χαμηλά στα δείγματα της ομάδας ελέγχου. Η μέση τιμή των αντιγράφων WT1/10⁴ αντίγραφα ABL στην ομάδα ελέγχου ήταν 80.2±25.6 (εύρος 0.1- 178). Τα δείγματα θεωρήθηκαν θετικά για WT1 αν η έκφρασή τους ήταν μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερη από το μέσο όρο της αντίστοιχης έκφρασης της ομάδας ελέγχου. Η Κ562 είχε υψηλή έκφραση (7896 αντίγραφα WT1/10⁴ αντίγραφα ABL). Η έκφραση του WT1 μελετήθηκε στη διάγνωση 14 παιδιών με οξεία λευχαιμία. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης του WT1 σε ολόκληρη την ομάδα των ασθενών ανέδειξε μέση τιμή αντιγράφων 1559.71 ±810.11 WT1/10⁴ αντίγραφα ABL (εύρος 15-10542). Πέντε από τους 14 ασθενείς (35.7%) παρουσίαζαν υψηλά επίπεδα έκφρασης WT1 με μέση τιμή 4250±1776.41 αντίγραφα WT1/10⁴ αντίγραφα ABL (εύρος 977-10542). Η διαφορά στην έκφραση του WT1 ήταν στατιστικά σημαντική ανάμεσα στους WT1 θετικούς ασθενείς και στην ομάδα ελέγχου (p=0.03) και ανάμεσα στους WT1 θετικούς και στους WT1 αρνητικούς ασθενείς (p=0.01). Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του PRAME και σε κλινικά χαρακτηριστικά, όπως ηλικία, φύλο, αριθμός λευκών αιμοσφαιρίων διάγνωσης, ανταπόκριση στη θεραπεία και συνολική επιβίωση στο 52.9% των ασθενών, οι οποίοι βρέθηκαν θετικοί για PRAME στην παρούσα μελέτη. Σημαντικά επίπεδα έκφρασης του WT1 παρατηρήθηκαν σε ποσοστό 35.7% των παιδιών στη διάγνωση οξείας λευχαιμίας. Στην παρούσα μελέτη, οι ασθενείς που ήταν θετικοί για WT1, με την εξαίρεση ενός, είχαν δυσμενή κλινική έκβαση. Η πλειονότητα των WT1 αρνητικών ασθενών συνεχίζουν να βρίσκονται σε πλήρη ύφεση. Έξι από τους εννέα (66%) ασθενείς που ήταν αρνητικοί για WT1, βρέθηκαν θετικοί για PRAME. Δύο από τους πέντε ασθενείς που ήταν θετικοί για WT1 δεν είχαν ανιχνεύσιμα επίπεδα PRAME. Το γεγονός ότι δεν ανιχνεύονται σε όλους τους ασθενείς και τα δύο γονίδια υποδεικνύει ότι ένας πιθανός συνδυασμός των παραπάνω γονιδίων μπορεί να αυξήσει τις πιθανότητες ανίχνευσης μοριακής υποτροπής σε ασθενείς με οξεία λευχαιμία. Τα αποτελέσματα της μελέτης δείχνουν αυξημένη έκφραση τόσο του γονιδίου WT1 όσο και του γονιδίου PRAME σε σημαντικό ποσοστό παιδιών με οξεία λευχαιμία κατά τη διάγνωση, εύρημα που θα μπορούσε να αξιοποιηθεί και στη χρήση των γονιδίων αυτών ως μοριακών δεικτών στην οξεία λευχαιμία της παιδικής ηλικίας.