Δείκτες χρόνιας έκθεσης σε φυτοφάρμακα: μελέτη εναπόθεσης οργανοφωσφορικών, καρβαμιδικών και οργανοχλωριομένων εντομοκτόνων στις τρίχες

Abstract

The main aim of the present study was the investigation of the possibility to use hair analysis as a tool for the assessment of chronic and low level exposure to pesticides, employing in vitro and in vivo experiments. The studied substances belong to the families of organophosphates, carbamates and organochlorines. A literature review revealed that no such studies have been conducted in the past. The disposition of organochlorine pollutants and pesticides in hair was also studied. The organochlorine pesticides under investigation are no longer used and the PCBs are byproducts of industrial activities. Exposure of the organisms to the aforementioned substances occurs either through the diet or from the environment. The first and crucial step was the development and validation of the analytical methods for the detection and quantification of the analytes of interest in a difficult matrix like hair. The pesticide diazinon was the model compound for the study of organophosphates incorporation in hair. Sample preparation included methanolic extraction of the pesticide from the hair matrix, at 37°C overnight, followed by liquid-liquid extraction with ethyl acetate, evaporation of the solvent under nitrogen, resuspension of the residue in 50 μl of methanol and analysis by GC-MS or GC-NPD. GC-MS analysis was performed in full scan and SIM mode. Analysis in SIM mode offered much better selectivity and sensitivity. Two ionization modes were also utilised; electronic ionisation and negative chemical ionisation with methane. Chemical ionisation mode offered much lower detection limits than the electronic ionization mode. The disposition of diazinon in hair from the environment was studied using fortified hair samples. Three parameters that would probably affect the detected concentration of diazinon in hair were studied; the concentration of diazinon in the exposure media, the time of exposure and the colour of the hair. Initially hair samples coming from the same person were immersed in aqueous solutions diazinon at different concentrations, for varying time periods. The samples were analysed by EI GC-MS following a decontamination rinse with water, drying, pulverization, methanolic extraction in an ultrasonic bath, liquid-liquid extraction with ethyl acetate, evaporation of the solvent and resuspension in 50 μl of methanol. It was found that the concentration of the pesticide detected in hair was proportional to the concentration of the exposure media and to the time of exposure. The same experiment was repeated using hair of different shades brown, coming from different people. The hair samples were immersed in aqueous solution of the pesticide at the same concentration and for the same time period. Our results indicated that in the case of external disposition of the pesticide in hair, the concentration of the pesticide is not related to the melanin content and hence the colour of the hair. On the other hand, other factors like the lipid content of the hair or the diameter of the hair fiber may play a more important role in the amount of pesticide detected. The next step was the study of incorporation of diazinon in hair in vivo. Rats and rabbits were used as our experimental animals. It is obvious by the difference in the literature reported LD₅₀ values that rabbits are more susceptible to diazinon toxicity than rats. Only a very small fraction of the administered doses was detected in the hair of the animals. The concentration of the pesticide detected in the hair of the rats was much higher than that detected in the hair of the rabbits even though the rabbits received higher doses than the rats. This may be explained by the different metabolic profile of the two animal species. Two methods were used for the detection of methomyl in the hair of experimental animals. The screening of the samples was performed by ELISA while the results were confirmed by HPLC. Even though ELISA gave acceptable results with methomyl there was significant background noise. Analysis with GC-MS was not possible due to the instability of the molecule. The exposure of the population to certain organochlorine compounds through the diet was also studied. The compounds studied were two organochlorine pesticides, DDT and lindane, and the following PCB congeners: PCB 28, 52, 99, 101, 118, 138, 149, 153, 156, 170, 180 and 187. A comparative study of the population exposure of three countries, Greece, Romania and Belgium was also conducted. The hair matrix was dissolved by incubation in HCl, and the samples were initially liquid-liquid extracted in a mixture of hexane: dichloromethane (4:1) and subsequently cleaned by SPE. Finally they were analysed by GCECD and GC-MS for confirmation. The Greek samples were found to be the most contaminated ones by organochlorine pesticides while they carried the smallest PCBs burden. Belgian samples were more contaminated by PCBs but carried a smaller pesticide burden while the samples from Romania contained less pesticide than the Greek ones but more than the Belgian ones. Three sensitive and selective analytical methods were developed and validated during the study of incorporation of diazinon in hair. They were based on GC-MS and GC-NPD detection and they were successful in detecting and quantitating diazinon in hair in the pg/mg level. It was confirmed by the in vivo studies in white rats and rabbits that diazinon may be detected in hair once it enters blood circulation, at concentrations proportional to the administered dose. When the detected pesticide concentrations in hair were compared, it became evident that metabolic species differences influence the quantity of non-metabolized pesticide circulating in the blood and hence the concentration detected in hair. The in vitro studies indicated that diazinon is deposited in hair not only in the case of exposure through the blood stream, but also in the case of external exposure. The concentration of the exposure media as well as the time of exposure does play a role in the detected pesticide concentration. On other hand the colour of the hair is not such a crucial parameter as it happens when substances are incorporated in the hair shaft from the sweat and sebum that bathe the shaft during the hair growth. The incorporation of methomyl in hair was studied using rabbits as experimental animals. It was confirmed that once it enters the blood stream it is detected in hair. Segmental hair analysis that was performed indicated that methomyl binds to specific sites and does not migrate along the hair shaft. This can be used in human exposure studies to obtain an accurate record of exposure, bearing in mind that human head hair grows approximately 1 cm/month. The main conclusion reached by the study of the organochlorine compounds was that contamination of the samples with the aforementioned substances was universal and that organochlorine concentration detected in the samples was related to the origin of the examined population. The Greek and occupationally exposed samples carried more DDTs, and less PCBs. The HCHs burden was similar for all the samples. In summary, during the present study sensitive and selective methods for the detection of minute quantities of pesticides in complex matrices were developed and validated, it was confirmed that the metabolic profile of an organism influences the concentration of pesticides detected in hair, and when external contamination of hair was studied, it was deduced that the concentration of pesticide in the exposure media as well as the time of exposure influences the concentration of the detected pesticides in hair. Segmental hair analysis that was performed in the case of methomyl and may be performed in human hair may give an accurate record of past exposure to pesticides. As a future development, hair disposition of certain characteristic metabolites of pesticides should be studied. Also it would be interesting to examine hair disposition of other commonly used pesticides. This is a potentially valuable additional tool for the assessment of chronic exposure to pesticides.

Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της δυνατότητας της χρήσης των τριχών σαν δείκτη χρόνιας και σε χαμηλά επίπεδα έκθεσης σε φυτοφάρμακα, και πιο συγκεκριμένα σε οργανοφωσφορικά και καρβαμιδικά εντομοκτόνα. Μελέτες αυτού του είδους δεν έχουν πραγματοποιηθεί μέχρι σήμερα. Για την επίτευξη του παραπάνω στόχου πραγματοποιήθηκαν πειράματα in vitro και μελέτες σε πειραματόζωα. Παράλληλα μελετήθηκε η εναπόθεση στις τρίχες οργανοχλωριομένων φυτοφαρμάκων και πολυχλωριομένων διφαινυλίων (PCBs), ουσίες που προσλαμβάνονται είτε μέσω της διατροφής, είτε από το περιβάλλον. Τα οργανοχλωριομένα φυτοφάρμακα δεν χρησιμοποιούνται πια και τα PCBs είναι παραπροϊόντα βιομηχανικών δραστηριοτήτων. Το πρώτο βασικό βήμα που έγινε ήταν η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την μέτρηση των προαναφερθέντων ουσιών σε ένα δύσκολο βιολογικό δείγμα όπως οι τρίχες, οι οποίες περιέχουν λιπίδια, κερατίνες, μελανίνη και άλλες ουσίες. Το εντομοκτόνο diazinon επιλέχθηκε ως η ένωση μοντέλο για τη μελέτη της εναπόθεσης των οργανοφωσφορικών στις τρίχες. Η προετοιμασία των δειγμάτων περιλάμβανε εκχύλιση του φυτοφαρμάκου από τις τρίχες με μεθανόλη στους 37°C όλη νύχτα, ακολουθούμενη από υγρή – υγρή εκχύλιση με αιθυλικό ακετυλεστέρα εξάτμιση του διαλύτη με άζωτο. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με GC-MS ή GC-NPD. Η ανάλυση GC-MS έγινε σε full scan mode και SIM mode. Το δεύτερο φίλτρο προσέφερε μεγαλύτερη ευαισθησία και περισσότερη εκλεκτικότητα. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι ιονισμού. Ηλεκτρονιακός ιονισμός και αρνητικός χημικός ιονισμός με μεθάνιο. Ο χημικός ιονισμός προσέφερε ακόμη μεγαλύτερη ευαισθησία στην ανάλυση. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι ο χημικός ιονισμός σπάει τις ουσίες σε λιγότερα ιόντα. Έτσι για το όριο ανίχνευσης για το diazinon ήταν δύο φορές πιο χαμηλό με τον χημικό ιονισμό από ότι με τον ηλεκτρονιακό. Ακολούθως μελετήθηκε η εξωτερική εναπόθεση του φυτοφαρμάκου σε ανθρώπινες τρίχες χρησιμοποιώντας φορτισμένα δείγματα. Μελετήθηκαν τρεις παράγοντες που μπορεί να επηρεάσουν τη συγκέντρωση που ανιχνεύεται. Οι τρίχες (ίδιου χρώματος) εμβαπτίστηκαν σε υδατικά διαλύματα διαφορετικών συγκεντρώσεων για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Ακολούθησε ξέπλυμα των δειγμάτων με νερό, στέγνωμα, ομογενοποίηση, εκχύλιση με μεθανόλη σε υδατόλουτρο με υπέρηχους, υγρή–υγρή εκχύλιση με αιθυλικό ακετυλεστέρα, εξάτμιση του διαλύτη, επαναδιάλυση σε 50 μl μεθανόλης και ανάλυση με ΕΙ GC-MS. Βρέθηκε ότι η συγκέντρωση του φυτοφαρμάκου ήταν ανάλογη της συγκέντρωσης του διαλύματος και του χρόνου εμβάπτισης. Το ίδιο πείραμα επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας τρίχες διαφορετικών αποχρώσεων του καστανού οι οποίες εμβαπτίστηκαν σε ίδιας συγκέντρωσης διάλυμα για ίδιο χρονικό διάστημα. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι το χρώμα της τρίχας δεν επηρεάζει σημαντικά την συγκέντρωση του φυτοφαρμάκου που προσδένεται σε αυτή από το περιβάλλον. Αντίθετα ίσως να παίζουν ρόλο άλλοι παράγοντες, όπως η λιπαρότητα ή η διάμετρος της τρίχας. Το επόμενο βήμα ήταν η μελέτη της απορρόφησης του φυτοφαρμάκου από τις τρίχες in vivo. Χρησιμοποιήθηκαν κουνέλια και αρουραίοι. Τα κουνέλια είναι ευαίσθητα στο diazinon ενώ οι αρουραίοι είναι ανθεκτικοί. Αυτό φαίνεται πολύ καθαρά από την διαφορά στις LD₅₀. Μόνο ένα πολύ μικρό ποσοστό από τις δόσεις που χορηγήθηκαν ανιχνεύθηκε στις τρίχες. Η συγκέντρωση του φυτοφαρμάκου που ανιχνεύθηκε ήταν διπλάσια στις τρίχες των αρουραίων από αυτή που ανιχνεύθηκε στις τρίχες των κουνελιών, παρόλο που στα κουνέλια είχαν χορηγηθεί μεγαλύτερες δόσεις. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός της παρουσίας μεγαλύτερης συγκέντρωσης των ενζύμων CYP 450 στα κουνέλια τα οποία μεταβολίζουν το diazinon σε diazoxon, ουσία πολύ πιο δραστική από τη μητρική. Για την ανίχνευση του methomyl χρησιμοποιήθηκε αρχικά ELISA ενώ η ταυτοποίηση έγινε με HPLC. Παρόλο που για το methomyl πήραμε αποδεκτά αποτελέσματα με ELISA, υπήρχε το μειονέκτημα των κρίσιμων παρεμβολών του υποστρώματος. Ήταν μάλιστα τόσο μεγάλο το πρόβλημα που η μέθοδος εγκαταλείφθηκε για τα υπόλοιπα φυτοφάρμακα. Η ανάλυση με GC-MS δεν ήταν εφικτή λόγω της διάσπασης του εντομοκτόνου κάτω από τις συνθήκες της ανάλυσης. Εκτός όμως από την επαγγελματική έκθεση υπάρχει και η έκθεση σε ουσίες μέσω της τροφής. Μελετήθηκε η έκθεση σε ουσίες όπως τα οργανοχλωριομένα φυτοφάρμακα, τα οποία έχουν πάψει να χρησιμοποιούνται εδώ και δεκαετίες και τα πολυχλωριομένα διφαινύλια (PCBs), τα οποία είναι παραπροϊόντα βιομηχανικής δραστηριότητας. Μάλιστα έγινε συγκριτική μελέτη σε πληθυσμό από την Ελλάδα, τη Ρουμανία και το Βέλγιο. Με την ολοκλήρωση της αξιολόγησης των μεθόδων, η ανάλυση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε αφού πρώτα οι τρίχες υδρολύθηκαν με υδροχλωρικό οξύ, εκχυλίστηκαν με υγρή-υγρή εκχύλιση με μίγμα εξανίου- διχλωρομεθανίου (4:1) και καθαρίστηκαν με solid phaseextraction σε στήλη με όξινο πυρίτιο. Για την ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε αέρια χρωματογραφία με electron capture detection (GC-ECD) και GC-MS για επιβεβαίωση. Τα Ελληνικά δείγματα βρέθηκε να είναι τα πιο επιβαρυμένα σε οργανοχλωριομένα εντομοκτόνα ενώ αντίθετα ανιχνεύθηκε μικρότερη ποσότητα PCBs. Τα Βελγικά δείγματα βρέθηκε να είναι πιο επιβαρυμένα με PCBs και να περιέχουν τα λιγότερα εντομοκτόνα, ενώ στα δείγματα από τη Ρουμανία ανιχνεύτηκαν λιγότερα εντομοκτόνα από τα ελληνικά αλλά περισσότερα από τα Βελγικά. Κατά τη μελέτη της εναπόθεσης του diazinon στις τρίχες, αναπτύχθηκαν τρεις αναλυτικές μέθοδοι βασισμένες σε αέρια χρωματογραφία συνδυασμένη με ανιχνευτή NPD και MS. Και οι τρεις μέθοδοι αποδείχτηκαν εκλεκτικές και ευαίσθητες για την ανίχνευση του diazinon στις τρίχες, σε επίπεδα εκατοντάδων pg/mg. Με τη χορήγηση του εντομοκτόνου diazinon λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας και λευκούς αρουραίους Sprague Dawley, επιβεβαιώθηκε ότι το diazinon εναποτίθεται στις τρίχες όταν εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος, και μάλιστα η συγκέντρωση που ανιχνεύεται στις τρίχες είναι ανάλογη με τη δόση χορήγησης. Συγκρίνοντας τις ανιχνευόμενες συγκεντρώσεις στα δύο είδη, είναι φανερό ότι το μεταβολικό τους προφίλ καθορίζει την ποσότητα του εντομοκτόνου που κυκλοφορεί στο αίμα και άρα την ποσότητα που ανιχνεύεται στις τρίχες. Τα in vitro πειράματα έδειξαν ότι το diazinon δεσμεύεται στις τρίχες και στην περίπτωση που η έκθεση είναι εξωτερική. Μάλιστα, καθοριστικό ρόλο στην ανιχνευόμενη συγκέντρωση στις τρίχες παίζουν η συγκέντρωση του εντομοκτόνου στο μέσο έκθεσης και ο χρόνος έκθεσης. Το χρώμα των τριχών και κατ’ επέκταση η περιεκτικότητα τους σε μελανίνη φαίνεται να παίζει δευτερεύοντα ρόλο στην ανιχνευόμενη συγκέντρωση. Πιο σημαντικό ρόλο παίζουν άλλα χαρακτηριστικά των τριχών, όπως η λιπαρότητα. Κατά τη μελέτη εναπόθεσης του methomyl στις τρίχες πειραματόζωων και της μέτρησης των επιπέδων του με γνωστές μεθόδους, επιβεβαιώθηκε ότι είναι δυνατή η ανίχνευση του στις τρίχες. Μάλιστα σε αυτήν τη μελέτη πραγματοποιήθηκε τμηματική ανάλυση τριχών η οποία απέδειξε ότι το methomyl δεσμεύεται σε συγκεκριμένα σημεία στην τρίχα, και η διάχυση του στο υπόλοιπο στέλεχος είναι περιορισμένη. Έτσι, ειδικά για τις ανθρώπινες τρίχες είναι δυνατό να έχουμε ένα ακριβές ιστορικό έκθεσης, αν παραδεχτούμε το γεγονός ότι η ανθρώπινη τρίχα μακραίνει περίπου ένα εκατοστό ανά μήνα. Το κύριο συμπέρασμα της μελέτης των οργανοχλωριομένων ήταν ότι οι ουσίες που εξετάσαμε ανιχνεύονται σε όλα τα δείγματα μας. Η επιβάρυνση φάνηκε να είναι ανάλογη με τον τόπο κατοικίας των ανθρώπων που πήραν μέρος στη μελέτη. Τα Ελληνικά δείγματα κατοίκων αγροτικών περιοχών με επαγγελματική έκθεση σε φυτοφάρμακα, ήταν περισσότερο επιβαρυμένα με DDTs, και λιγότερο επιβαρυμένα με PCBs. Αντίστοιχα η επιβάρυνση με ισομερή του εξαχλωροκυκλοεξανίου ήταν παρόμοια και στις τρεις χώρες. Συμπερασματικά κατά τη διάρκεια της διατριβής καταρχήν αναπτύχθηκαν αναλυτικές μέθοδοι ανίχνευσης μιας σειράς εντομοκτόνων σε δύσκολα βιολογικά δείγματα όπως οι τρίχες, εξετάστηκε κατά πόσο η διαφορά στο μεταβολισμό επιδρά στην ανιχνευόμενη συγκέντρωση φυτοφαρμάκου όταν η απορρόφηση γίνεται συστηματικά και εξετάστηκε κατά πόσο επιδρά στην απορρόφηση η ποιότητα και το χρώμα της τρίχας όπως και η συγκέντρωση των διαλυμάτων και ο χρόνος έκθεσης στο φυτοφάρμακο diazinon. Η μελέτη έχει επεκταθεί και σε άλλες οικογένειες φυτοφαρμάκων, με σκοπό να συσχετίσουμε τη συγκέντρωση στις τρίχες με τυχόν συμπτώματα των αγροτών τα οποία πιθανώς να σχετίζονται με τη χρόνια έκθεση σε φυτοφάρμακα.