Ρύθμιση της βιοσύνθεσης των πολυαμινών και μεταβολικός έλεγχος του συστήματος μεταφοράς σήματος δύο συστατικών

Abstract

The aim of the present work was to provide experimental evidence on the function of the AtoS-AtoC/Az as a two-component system in E. coli, since the products of atoS and atoC/Az genes share significant homology with sensor kinases and response regulators of the fore mentioned systems, respectively. AtoC/Az is a multi-functional protein: a) It is a non-competitive inhibitor of ornithine decarboxylase, the key enzyme in polyamine biosynthesis, b) it positively regulates the expression of atoDAEB operon encoded enzymes controlling short-chain fatty acid catabolism in E. coli upon acetoacetate induction, c) it is necessary for the copolymer poly-(3-hydroxy-boutyrate-3-hydroxy-valerate) production in a recombinant E. coli K-12 strain and d) very recently, it has been reported to affect the expression of genes participating in flagellar synthesis in E. coli K-12. In the present work, the ability of the putative kinase AtoS to phosphorylate AtoC/Az was investigated. His10-tagged AtoC/Az was overproduced in E. coli, purified by Ni2+ affinity chromatography and phosphorylated in vitro by membrane kinase AtoS. This phopshorylation was improved when F0F1-ATPase was stripped from the membranes. Chemical stability tests and alkaline hydrolysis of phosphorylated AtoC/Az followed by TLC and reversed-phase HPLC analysis of the hydrolysate revealed histidine as the phosphorylated amino acid residue in AtoC/Az, thus classifying AtoC/Az to a novel type of response regulators. AtoC/Az sequence computational analysis indicated the presence of the characteristic “H-box” found in histidine kinases with the consensus sequence SHETRTPV, spanning residues 72-79, where H73 might be the target of phosphorylation. Moreover, the AtoC/Az responsive element was mapped in the atoDAEB operon promoter. Promoter deletions followed by measuring for β-galactosidase activity in the presence of the inducer, acetoacetate, as well as initial band-shifting and footprinting experiments revealed the ability of AtoC/Az to bind a DNA sequence containing two 12 bp “dyad symmetry” regions centered 150 and 180 bp upstream the transcriptional start of atoDAEB operon. In the same context, a 10 bp DNA region negatively regulating the expression of atoDAEB operon was mapped, centered 30 bp upstream the first codon of atoD. Finally, a prediction of the 3D-structure of the N-terminal (regulatory) and Cterminal (DNA binding) domains of AtoC/Az was presented revealing the characteristic five parallel β-strands surrounded by five a-helices and helix-turn-helix motifs, respectively.

Ο στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να αποδειχτεί πειραματικά ότι τα προϊόντα των γονιδίων atoS και atoC/Az συνιστούν ένα σύστημα μετάδοσης σήματος δύο συστατικών στο βακτήριο E. coli, αφού παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με τις αισθητήριες κινάσες και τους ρυθμιστές απόκρισης αυτών των συστημάτων, αντίστοιχα. Η πρωτεΐνη AtoC/Az είναι μία πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη: α) Αποτελεί μη συναγωνιστικό αναστολέα της αποκαρβοξυλάσης της ορνιθίνης, του ενζύμου- κλειδιού της βιοσύνθεσης των πολυαμινών, β) ρυθμίζει θετικά την έκφραση των ενζύμων που κωδικοποιούνται από το οπερόνιο atoDAEB και που ελέγχουν τον καταβολισμό των λιπαρών οξέων μικρής αλυσίδας στο E. coli κατά την επαγωγή με ακετοξικό οξύ, γ) είναι απαραίτητη για την παραγωγή του συμπολυμερούς πολυ-(3- υδροξυβουτυρικού-3-υδροξυβαλερικού οξέος) σε ανασυνδυασμένο στέλεχος E. coli K-12 και δ) πολύ πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι επηρεάζει την έκφραση των γονιδίων που συμμετέχουν στη σύνθεση των μαστιγίων και κατ’ επέκταση στη χημειώταξη στο E. coli K-12. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η ικανότητα της αισθητήριας κινάσης AtoS να φωσφορυλιώνει την AtoC/Az. Η πρωτεΐνη AtoC/Az υπερεκφράστηκε σε E. coli ως πρωτεΐνη σύντηξης με ουρά 10 ιστιδινών, καθαρίστηκε με χρωματογραφία αγχιστείας Ni2+ και φωσφορυλιώθηκε in vitro από τη μεμβρανική κινάση AtoS. Η φωσφορυλίωση αυτή βελτιώθηκε όταν έγινε κατεργασία απενεργοποίησης της μεμβρανικής F0F1-ATPάσης. Πειράματα χημικής σταθερότητας του φωσφορικού δεσμού του φωσφοαμινοξέος της AtoC/Az και αλκαλική υδρόλυση της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης ακολουθούμενη από ανάλυση του πρωτεϊνικού υδρολύματος με TLC και HPLC ανάστροφης φάσης αποκάλυψαν την ιστιδίνη ως το φωσφορυλιωμένο αμινοξύ της AtoC/Az, κατατάσσοντας με αυτόν τον τρόπο την AtoC/Az σε μία νέα τάξη ρυθμιστών απόκρισης. Ανάλυση της αλληλουχίας της AtoC/Az με υπολογιστικά προγράμματα έδειξε την παρουσία του χαρακτηριστικού “Η-κουτιού” που συναντάται στις κινάσες ιστιδίνης με την αλληλουχία SHETRTPV, αμινοξέα 72-79, όπου η Η73 μπορεί να αποτελεί το στόχο της φωσφορυλίωσης. Επιπλέον, χαρτογραφήθηκε η θέση δέσμευσης της AtoC/Az στον προαγωγέα του οπερονίου atoDAEB. Διαδοχικές απαλείψεις περιοχών του προαγωγέα ακολουθούμενες από προσδιορισμό δραστικότητας β-γαλακτοσιδάσης παρουσία του επαγωγέα, ακετοξικού οξέος, καθώς και πρωταρχικά πειράματα αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας και προστασίας από δράση DNAσης Ι των συμπλόκων DNA-AtoC/Az αποκάλυψαν την ικανότητα της AtoC/Az να δεσμεύει μία αλληλουχία DNA που περιέχει δύο περιοχές “δυαδικής συμμετρίας”. Οι περιοχές αυτές έχουν μήκος 12 bp η κάθε μία και τα κέντρα τους εντοπίζονται 150 και 180 bp ανοδικά της μεταγραφικής αρχής του οπερονίου atoDAEB. Μέσα στο πλαίσιο της χαρτογράφησης του προαγωγέα, βρέθηκε, επίσης, μία περιοχή μήκους 10 bp, που ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του οπερονίου atoDAEB, το κέντρο της οποίας βρίσκεται 30 bp ανοδικά του εναρκτήριου κωδικονίου του γονιδίου atoD. Τέλος, στην παρούσα μελέτη παρουσιάστηκε ένα μοντέλο της τρισδιάστατης δομής της Ν-τελικής (ρυθμιστικής) και της C-τελικής (δέσμευσης στο DNA) περιοχής της AtoC/Az, που αποκάλυψε τα χαρακτηριστικά μοτίβα των πέντε παράλληλων β-ελασμάτων που περιβάλλονται από 5 α-έλικες και της έλικας- στροφής-έλικας, αντίστοιχα.