Υγροχρωματογραφικός προσδιορισμός των καταλοίπων της υδροχλωρικής σαραφλοξακίνης μετά από χορήγηση αυτής με την τροφή σε εκτρεφόμενες τσιπούρες

Abstract

In this thesis, a new high performance liquid chromatographic method with two detectors (HPLC-SFD-PDA) for the reliable identification, confirmation and quantification of sarafloxacin residues in muscle plus skin, liver, kidney and vertebra of gilthead seabream (Sparus aurata L.), has been developed. According to this method an acidified methanol tissue extract is subjected to sorbent extraction on a cation exchange cartridge. Sarafloxacin quantitative elution is done with an ammoniated methanol solution and after a partition step with n-hexane the final extract is evaporated to dryness, reconstituted in mobile phase and injected to the HPLC for fluorescence identification. The chromatographic conditions are the following: - Analytical column Zorbax SB-C18, 5 μm [250 mm x 4,6 mm] – Guard column Lichrospher RP – select b, 5 μm – Column temperature 60°C – Mobile phase 30% Acetonitrile:Methanol [3 + 2] v/v 70% Trifluoroacetic 0.1%, pH 2,15 – Flow rate 0,9 mL.min-1 – Final extract volume 1000 μL - Autosampler’s temperature 15°C – Injection volume 20 μL – Pump mode Isocratic – Electronic counterbalance 100 – Attenuation S. - Measuring units mV - SFD wavelength settings λex ~ 278 nm & λem~ 450 nm - UV wavelength setting λmax ~ 280 nm. With the above conditions sarafloxacin is eluted form the chromatographic column at a retention time of 6,983 ± 0,008 min [n = 10]. This method was validated for specificity, linearity, accuracy, precision, sensitivity, and intra – inter assay precision. Linearity was very good in the concentration range from 2 – 320 μg/kg. The correlation coefficient was found to be 0,999998. Accuracy data suggested an mean overall recovery of 82,1 ± 4,2 [RSD = 5,1%] for muscle plus skin, 79,2 ± 1,9 [RSD = 2,4%] for liver, 79,1 ± 4,3 [RSD = 5,4%] for kidney and 76,1 ± 3,3 [RSD = 4,3] for vertebra. Precision data, expressed in percent relative standard deviation, ranged from 0,96 to 6,46% in all tissue analyzed. The sensitivity, which corresponds to the slope of the calibration standard curve, was determined by calculating the factors Resolution [Rs = 1,25], Tailing factor [Tf = 1,847583e + 000] and signal to noise ration [S/N = 2]. Intra-assay precision [within day], was determined by the relative standard deviation of the results obtained for 6 spiked samples at 40 μg/kg level [RSD = 2,3%]. Inter-assay precision [between day], was determined by the overall inter assay variability of the results obtained from 5 spiked samples at 5 different levels, five times each [RSD = 4,5%]. Finally, the detection limit [LOD] was 1 μg/kg in muscle plus skin tissue of the gilthead seabream. This HPLC method was used to monitor sarafloxacin concentrations in tissues of cultured gilthead seabream during a medication period of 5 days and for 4 days after the last in feed administration at the therapeutic dose of 10 mg/kg body weight/day for 5 consecutive days. Three experiments were conducted in seawater during spring, summer and winter. One pilot experiment at 19,7 ± 1,18°C with 3 seabreams per sampling point, followed by two large scale experiments, one at high temperature of 25,19 ± 1,4°C, one at low temperature of 17,83 ± 0,26°C with 10 seabreams per sampling point. From this study it was found that sarafloxacin residues in seabream tissues at three different temperatures are depleted rapidly and fall below the Maximum Residue Limit of 30 μg/kg in 48 hours after the last dosing day. Also, at 108 hours after the last dose sarafloxacin concentrations were close to the LOD – 1 μg/kg in all tissues analyzed. Gilthead seabream market samples coming from Greek fish farming industries were analyzed in order to investigate the presence of sarafloxacin residues. Sarafloxacin residues were not detected to any fish sample. Finally, withdrawal period form muscle plus skin of the farmed gilthead seabream was calculated and it was found to be 42,2 hours.

Με την έρευνα αυτή κατέστη δυνατή η τυποποίηση και τεκμηρίωση μιας αναλυτικής υγροχρωματογραφικής μεθόδου (HPLC-SFD-PDA) για την αξιόπιστη ανίχνευση, ταυτοποίηση και το ποσοτικό προσδιορισμό των καταλοίπων της σαραφλοξακίνης στη σάρκα, στο ήπαρ, στους νεφρούς και στα οστά της τσιπούρας εντατικής εκτροφής. Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, ένα όξινο αιθανολικό εκχύλισμα του δείγματος υποβάλλεται σε καθαρισμό σε μικροστήλη ανταλλαγής ιόντων για τη συγκράτηση της σαρφλοξακίνης στο ειδικό αυτό υλικό. Η αποδέσμευση της σαραφλοξακίνης και η ποσοτική της παραλαβή γίνεται με αλκαλικό διάλυμα μεθυλικής αλκοόλης. Μετά από απομάκρυνση των μη πολικών ουσιών με εξάνιο το εκχύλισμα εξατμίζεται μέχρι ξηρού με θερμοκρασία και άζωτο και αναγεννάται σε κινητή φάση για έγχυση στον υγρό χρωματογράφο και ανίχνευση με ανιχνευτή φθορισμού. Η μέση ανάκτηση της μεθόδου προσδιορίστηκε σε 82,1 ± 4,2 [RSD = 5,1%] για τη σάρκα, σε 79,2 ± 1,9 [RSD = 2,4%] για το ήπαρ, σε 79,1 ± 4,3 [RSD = 5,4%] για τους νεφρούς και σε 76,1 ± 3,3 [RSD = 4,3] για τα οστά. Οι χρωματογραφικές συνθήκες είναι οι παρακάτω: - Αναλυτική στήλη Zorbax SB-C18, 5 μm [250 mm x 4,6 mm] – Προστήλη Lichrospher RP – select b, 5 μm – Θερμοκρασία στήλης 60°C – Κινητή φάση 30% Ακετονιτρίλιο:Μεθυλική αλκοόλη [3 + 2] v/v 70% Τριφθοροξικό οξύ 0.1%, pH 2,15 – Ροή κινητής φάσης 0,9 mL.min-1 – Τελικός όγκος εκχυλίσματος 1000 μL – Θερμοκρασία δειγμάτων 15°C – Όγκος έγχυσης δείγματος 20 μL – Λειτουργία αντλίας ισοκρατική – Ηλεκτρονική αντιστάθμιση 100 – Ενίσχυση σήματος S – Μονάδες κλίμακας mV - Μήκη κύματος [φθορισμός] λex ~ 278nm & λem ~ 450 nm – Μήκος κύματος [υπεριώδες] λmax ~ 280 nm. Με τις παραπάνω χρωματογραφικές συνθήκες η σαραφλοξακίνη εκλούεται από τη χρωματογραφική στήλη σε χρόνο Rt = 6,983 ± 0,008 min [n = 10 ]. Η τεκμηρίωση της μεθόδου βασίσθηκε στην εξειδίκευση, γραμμικότητα, πρότυπες καμπύλες, όριο ανίχνευσης, όριο ποσοτικού προσδιορισμού, ανάκτηση, ακρίβεια, ευαισθησία και επαναληψιμότητα. Η γραμμικότητα ήταν πολύ καλή για συγκεντρώσεις από 2 – 360 μg/kg. Ο συντελεστής συσχέτισης ήταν 0,999998. Η ακρίβεια της μεθόδου βασίσθηκε στη μέση τεκμηριωμένη ανάκτηση της μεθόδου η οποία υπολογίσθηκε σε 82,1 ± 4,2% για τη σάρκα, 79,2 ± 1,9% για το ήπαρ, 79,1 ± 4,3% για τους νεφρούς και 76,1 ± 3,3% για τα οστά. Η σχετική πρότυπη απόκλιση [RSD%] κυμάνθηκε από 0,96 έως 6,5% για όλους τους ιστούς, οι οποίοι αναλύθηκαν. Η ευαισθησία, η οποία αντιστοιχεί στην κλίση της πρότυπης καμπύλης, προσδιορίσθηκε με τον υπολογισμό των συντελεστών διαχωριστικότητας [Rs = 1,3], παραμόρφωσης [Tf = 1,847583e + 000] και του λόγου σήματος προς θόρυβο [S/N = 2]. Η ακρίβεια αναλύσεων στην ίδια ημέρα εργασίας [within day], προσδιορίσθηκε με την σχετική πρότυπη απόκλιση των αποτελεσμάτων από 6 επιβαρημένα δείγματα με 40 μg/kg [RSD = 2,34%]. Η ακρίβεια αναλύσεων μεταξύ διαφόρων ημερών εργασίας [between day], προσδιορίσθηκε με τη μέση διακύμανση των αποτελεσμάτων από 5 επιβαρυμένα δείγματα σε 5 διαφορετικά επίπεδα και για 5 φορές έκαστο [RSD = 4,5%]. Τέλος, το όριο ανίχνευσης της μεθόδου [LOD] ήταν 1 μg/kg στη σάρκα της τσιπούρας εκτροφής. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο των καταλοίπων της υδροχλωρικής σαραφλοξακίνης στους ιστούς της τσιπούρας εκτροφής μετά από τη χορήγηση μαζί με την τροφή για 5 ημέρες και για 4 ημέρες μετά την παύση χορήγησης στη θεραπευτική δόση των 10 mg/kg σ.β./ημέρα. Πραγματοποιήθηκαν τρία πειράματα σε θαλασσινό νερό κατά την άνοιξη, το καλοκαίρι και το χειμώνα. Ο διερευνητικός πειραματισμός έγινε σε θερμοκρασία 19,7 ± 1,2°C με δείγμα 3 ψαριών ανά ημέρα δειγματοληψίας. Ακολούθησαν οι δύο κύριοι πειραματισμοί, ένας σε υψηλή θερμοκρασία των 25,2 ± 1,4°C και ένας σε χαμηλή θερμοκρασία των 17,8 ± 0,3°C και δείγμα 10 ψαριών ανά ημέρα δειγματοληψίας. Από τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής διαπιστώθηκε ότι η σαρφλοξακίνη κατανέμεται σε όλους τους ιστούς της τσιπούρας και αποβάλλεται τάχιστα, φθάνοντας σε επίπεδα πολύ πιο κάτω από το MRL των 30 μg/kg εντός 48 ωρών μετά από την τελευταία δόση. Επίσης 108 ώρες μετά την τελευταία δόση οι συγκεντρώσεις της σαραφλοξακίνης βρίσκονται κοντά στο όριο ανίχνευσης της μεθόδου [LOD = 1 μg/kg] σε όλους τους ιστούς που αναλύθηκαν. Διερευνήθηκε η τυχόν παρουσία καταλοίπων σαραφλοξακίνης σε δείγματα της αγοράς από τσιπούρες οι οποίες προέρχονταν από διάφορες συστηματικές εκτροφές της χώρας μας. Σε κανένα δείγμα δε βρέθηκαν κατάλοιπα της σαραφλοξακίνης. Τέλος υπολογίσθηκε στατιστικά ο χρόνος απομάκρυσης της σαραφλοξακίνης από τη σάρκα της εκτρεφόμενης τσιπούρας ο οποίος είναι 42,2 ώρες.