Καθαρισμός - βιοχημικός χαρακτηρισμός χιτινασών και απομόνωση - κλωνοποίηση τμήματος του γονιδίου ενός χιτινολυτικού ενζύμου απο το υπερθεμόφιλο, αναερόβιο αρχαιοβακτήριο thermococcus chitonophagus

Abstract

In the context of her PhD thesis, executed at the Laboratory of Biochemistry, Department of Biology, University of Athens, E. Andronopoulou undertook the general study of the chitinoclastic, enzymatic system of the hyperthermophilic, strictly anaerobic, sulfur-dependent archaeon Thermococcus chitonophagus. This is the first archaeon discovered to possess chitinolytic properties, i.e. it can grow on a minimal medium, with the addition of chitin, as the exclusive source of carbon, nitrogen and energy. This research work is the first report on chitinolytic enzymes isolated and studied, on the biochemical level and in the form of native proteins, from Archaea and more generally, anaerobic organisms. Chitin, a highly isoluble biopolymer, composed of N-acetyl-glucosamine residues, is abundant in nature, occurring mainly in the marine environment. It is due to this abundance, as well as, the special chemical properties, attributed to chitin and its derivatives, that a general biotechnological and industrial interest was recently increased. The naturally-occurring degraders of this biopolymer are mainly aerobic organisms and very little is known, so far, of the anaerobic degradation of chitin. Therefore, the anaerobic and, in particular, the hyperthermophilic organisms, capable of degrading and/or modifying chitin, present an interesting field for research, especially due to the expectancy that the chitinolytic enzymes isolated from such organisms may exhibitextraordinary thermal and chemical stability. At the initial stage of the experimental part, a series of factors affecting the anaerobic culture of this archaeon, such as the optimum temperature, the agitation speed, the type of chitin used, the effect of the reducing agent and the inoculum, were elucidated. T. chitonophagus was cultivated in batch cultures, in a nitrogen atmosphere and in two major types of complex medium, supplemented with elementary sulfur, the minimal, inducing medium, containing chitin, as the sole carbon, nitrogen and energy source, and the rich, non-inducing medium, where chitin was replaced by a variety of nutrient, non-chitinous substrates. The above investigation was performed with a large series of kinetic experiments in order to study the growth rate, as well as, the rate of increase of the total chitinolytic activity, during incubation for 96 hrs., under a variety of conditions. These experiments demonstrated that Τ. chitonophagus produces various chitinolytic enzymes, following induction with various types of chitin, as well as, cellulose and the dimer and trimer of chitin. Among all investigated potential inducers and nutrient substrates, colloidal chitin exerted the strongest inducing effect, whereas the highest levels of growth rate were obtained in the presence of yeast extract and peptone, in absence of chitin. Despite the indisputable fact that the chitinolytic genes of this archaeon are highly expressed in the presence of chitin. i.e. they are strongly induced, there is a considerable production of chitinolytic enzymes, yet at lower levels, in the absence of chitin, i.e. there is a low-level constitutive expression of the respective genes. A probable explanation is that the presence of chitooligosaccharides, as well as, other structurally similar molecules, in traces in the rich medium, act as potential inducers of the chitinolytic activity. T. chitonophagus produces several chitinases, which are co-isolated with the major cellular chitinase, chi70, in the clarified, soluble membrane extract, as it has beendemonstrated with analysis of various samples on a chitinase zymogram. On the other side, a distinct chitinolytic activity was detected in the culture supernatant and isolated following concentration and enrichment, using differential fractionation with ammonium sulfate and subsequent chromatographic purification. The secreted, extracellular chitinase. chi50, was partially purified and the apparent molecular weight was determined to be 50 kDa. The optimum pH and temperature were found to be 6.0 and 80°C, respectively. Chi50 is an endochitinase, as it was determined by TLCanalysis of the hydrolysis products of colloidal chitin. A cell membrane-associated chitinase. chi70 was purified to homogeneity and fully characterized. This enzyme seems to be the major chitinase of this archaeon. A clarified, soluble and enriched in chi7G, "membrane" extract was prepared, using-arr appropriately selected detergent and subsequently subjected to differential fractionation with ammonium sulfate and two-step chromatographic purification, employing a hydrophobic TSK-butyl column and the anion exchanger MonoQ. The enzyme presented pH and temperature optima at 7 0 and 70°C, respectively. The chi70 is a monomelic protein, with an apparent molecular weight, as determined by denaturing polyacryalamide electrophoresis, of 70 kDa and a native molecular weight of 77 kDa, as estimated by size exclusion chromatography. The isoelectric point was determined at 5.9, while various indications support the view that chi70 is a membrane embedded protein. The enzyme is characterized by remarkable thermostability (preserving 50% of activity after 1 hr. incubation at 120° C), as well as, extraordinary chemical stability,remaining active in the presence of various denaturing agents, such as chaotropic salts, detergents and organic solvents. Chi70 was, also, totally resistant to the general, natural inhibitor of chitinolytic activity, allosamidin. This chitinase is an endo-type enzyme that displays a broad substrate specificity, hydrolysing a variety of chitinous and non-chitinous, polymeric and oligomeric, natural and synthetic substrates. Considerable activiy was detected towards cellulose and other structurally-related dimeric substrates, containing glucose, instead on N-acetylglucosamine, subunits. This activity can be attributed to the presence of a second, distinct active site, carrying the additional, inherent cellulolytic activity of this enzyme. The lowest Km and highest Vmax and Kcat values were determined with colloidal chitin, among natural substrates and pNP-diacetylchitobiose, the trimer of chitin, among various synthetic substrates. The combination of high thermal (the highest, so far, reported for chitinases) and chemical stability, as well as, the resistance to specific and non-specific inhibitors, make this enzyme unique among other known to date chitinases. This is the first chitinase purified and characterized from archaea and the first ever membrane chtinase isolated and studied. In the second part of the experimental work, a considerable number of genomic libraries was constructed, following cloning of the T. chitonophagus genomic DNA in the ÀZap phage vector. The libraries were mass-excised and converted to the phagemid libraries and, subsequently, to mixed plasmid populations. All types of libraries were screened for probable clones of chitinase and chitobiase, using sensitive enzyme substrates, as well as, specific and degenerate primers, in combination with PCR. A 189 bp-chitinase gene fragment, was isolated, using PCR with specific primers and two selected plasmid libraries, as template. This gene fragment showed strong homology with a large numbers of chitinase genes from various organisms and particularly with the first and only so far known, chitinase gene, PKchiA, isolated from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis. This gene fragment was subcloned in a suitable expression vector (pET31b, Novagen) and overexpressed in the appropriate E. coli strain [BLR(DE3)pLysS]. The 63-aminoacids, coded peptide was isolated in high concentration and purity to allow immunization experiments. The resulting polyclonal antibody was used to investigate the probable immunochemical affinity of this peptide to other chitinases. Strong reaction was observed with the archaeal, membrane chi70, as well as the eubacterial chiA isolated from Serratia marcescens. The peptide could be part of the chi70 protein, but it could also belong to a distinct chitinase, coded from a different gene, or even from the same gene, following post-transcriptional, or post-translational modification(s).

Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Αθηνών, η μελέτη του χιτινολυτικού ενζυμικού συστήματος από το υπερθερμόφιλο, αυστηρά αναερόβιο και θείο-εξαρτώμενο αρχαιοβακτήριο Thermococcus chitonophagus. Ο οργανισμός αυτό είναι το πρώτο αρχαιοβακτήριο στο οποίο ανιχνεύθηκε χιτινολυτική ενεργότητα, δηλαδή διαπιστώθηκε ότι μπορεί να αναπτυχθεί με αποκλειστική πηγή άνθρακα, αζώτου και ενέργειας, τη χιτίνη. Μέχρι σήμερα δεν είχε μελετηθεί κανένα χιτινολυτικό ένζυμο, στο επίπεδο της φυσικής πρωτεΐνης, από αναερόβιο βακτηριακό υλικό, ή από αρχαιοβακτήρια. Η χιτίνη, με δομή παρόμοια προς την κυτταρίνη, είναι ένα φυσικό βιοπολυμερές αμινοσακχάρων, που απαντά σε αφθονία στη φύση, ιδιαίτερα στο θαλάσσιο περιβάλλον και παρουσιάζει -ακριβώς λόγω της αφθονίας και των ειδικών χημικών ιδιοτήτων της- σημαντικό βιοτεχνολογικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον. Οι αποικοδομητές του βιοπολυμερούς αυτού είναι αερόβιοι, κυρίως, οργανισμοί, ιδιαίτερο όμως ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι αναερόβιοι, υπερθερμόφιλοι αποικοδομητές της χιτίνης, καθώς και τα χιτινολυτικά ένζυμα που απομονώνονται από αυτούς, λόγω των εξαιρετικών και μοναδικών ιδιοτήτων που παρουσιάζουν και συγκεκριμένα της θερμικής και χημικής σταθερότητας. Στο αρχικό στάδιο του πειραματικού μέρους, διερευνήθηκε μια σειρά παραγόντων που επηρεάζουν την αναερόβια καλλιέργεια του αρχαιοβακτηρίου, όπως η θερμοκρασία, η ταχύτητα ανακίνησης, το είδος της χιτίνης, η δράση του αναγωγικού μέσου και η ποιότητα-ποσότητα-ηλικία του εμβολίου. Ο οργανισμός αυτός αναπτύχθηκε σε ατμόσφαιρα Ν2, σε κλειστή καλλιέργεια, στους 85°C και με δύο βασικούς τύπους θρεπτικού υλικού, το επαγωγικό, που περιέχει χιτίνη, ως αποκλειστική πηγή άνθρακα, αζώτου και ενέργειας, και το μη επαγωγικό, στο οποίο η χιτίνη έχει αντικατασταθεί από μια ποικιλία άλλων θρεπτικών υποστρωμάτων. Η διερεύνηση των ανωτέρω παραγόντων έγινε με την εκτέλεση μεγάλου αριθμού πειραμάτων κινητικής, με τα οποία μελετήθηκαν ο ρυθμός της κυτταρικής αύξησης, καθώς και ο ρυθμός αύξησης της συνολικής χιτινολυτικής ενεργότητας, σε συνολικό χρονικό διάστημα επώασης 96 ωρών. Διαπιστώθηκε, έτσι, ότι το αρχαίο βακτήριο Τ. chitonophagus παράγει μια σειρά από χιτινολυτικά ένζυμα, μετά από επαγωγή με διάφορες μορφές χιτίνης αλλά και με άλλα υποστρώματα, όπως κυτταρίνη, καθώς και το διμερές και το τριμερές της χιτίνης. Ανάμεσα σε όλους τους δυνητικούς επαγωγείς και τα πιθανά θρεπτικά υποστρώματα που εξετάσθηκαν, διαπιστώθηκε ότι η εντονότερη επαγωγή επιτυγχάνεται με παρουσία κολλοειδούς χιτίνης (ημι-διαλυτής μορφής χιτίνης), ενώ τα υψηλότερα επίπεδα κυτταρικής αύξησης παρατηρήθηκαν παρουσία εκχυλίσματος ζύμης και πεπτόνης και απουσία χιτίνης. Παρά το αναμφισβήτητο γεγονός ότι η συνολική χιτινολυτική ενεργότητα εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα παρουσία χιτίνης, υπάρχει δηλ. θετική επαγωγή, η απουσία της δεν παρεμποδίζει τη συνεχή έκφραση των αντιστοίχων γονιδίων και τη συνεχή παραγωγή χιτινολυτικών ενζύμων (constitutive expression), σε χαμηλότερα επίπεδα. Μια πιθανή ερμηνεία είναι ότι η παρουσία ιχνών χιτο-ολιγοσακχαριτών, ή και άλλων δομικά παρόμοιων σακχάρων, στο πλούσιο (μη επαγωγικό) θρεπτικό μέσο, επάγει, σε μικρότερα έστω επίπεδα, την έκφραση των χιτινολυτικών γονιδίων. Όπως αποδείχθηκε με ενζυμόγραμμα χιτινάσης, ο Τ. chitonophagus παράγει περισσότερες από μία χιτινάσες, οι οποίες συν-απομονώνονται με την κύρια κυτταρική χιτινάση chi70, στο διαυγές, διαλυτό, «μεμβρανικό» εκχύλισμα. Εξάλλου, στο υπερκείμενο της καλλιέργειας ανιχνεύθηκε μία διακριτή χιτινολυτική ενεργότητα, μετά από κατάλληλη συμπύκνωση του υλικού, με διαφορική κλασμάτωση με θειικό αμμώνιο και επακόλουθο χρωματογραφικό καθαρισμό. Η εκκρινόμενη αυτή χιτινάση (chi50) καθαρίστηκε μερικώς και προσδιορίστηκε το φαινόμενο μοριακό βάρος της (-50 kDa), η βέλτιστη θερμοκρασία (80°C) και το βέλτιστο pH (6.0). Διαπιστώθηκε, επίσης, μετά την ανίχνευση των τελικών προϊόντων δράσης του ενζύμου σε υπόστρωμα κολλοειδούς χιτίνης, ότι πρόκειται για μια ενδοχιτινάση. Στα επόμενα στάδια του πειραματικού μέρους της διατριβής, καθαρίσθηκε σε ομοιογένεια και χαρακτηρίσθηκε πλήρως μία κυτταρική, και μάλιστα μεμβρανική, χιτινάση. η chi70, η οποία πιθανότατα είναι η κύρια χιτινάση του αρχαιοβακτηρίου. Η χιτινάση αυτή απομονώθηκε από την κυτταρική μεμβράνη του αρχαιοβακτηρίου, μετά από κατάλληλη διαλυτοποίηση με επιλεγμένο απορρυπαντικό, διαφορική κλασμάτωση με θειικό αμμώνιο και χρωματογραφικό καθαρισμό δύο σταδίων, το πρώτο στην υδρόφοβη στήλη TSK-butyl και το δεύτερο στο γνωστό ανιοντοανταλλάκτη MonoQ. Ακολούθησε πλήρης βιοχημικός χαρακτηρισμός με τη χρήση των καθαρών κλασμάτων από τη δεύτερη χρωματογραφική στήλη. Προσδιορίσθηκε, έτσι, το βέλτιστο pH στο 7.0 και η βέλτιστη θερμοκρασία στους 70° C. Η chi70 είναι μία μονομερής πρωτεΐνη, με φαινόμενο μοριακό βάρος που εκτιμήθηκε στα 70 kDa, με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα ακρυλαμίδης, και στα 77 kDa, με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης προσδιορίσθηκε στο 5.9, ενώ διάφορες ενδείξεις συνηγορούν ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη. Η χιτινάση αυτή χαρακτηρίζεται από εξαιρετική θερμοσταθερότητα (αφού διατηρεί το 50% της ενεργότητας μετά από επώαση μιας ώρας στους 120°), αλλά και από αξιοσημείωτη χημική σταθερότητα έναντι μιας σειράς ποικίλων αποδιατακτικών παραγόντων -χαοτροπικών ενώσεων, απορρυπαντικών και οργανικών διαλυτών, αλλά και αναγωγικών και αλκυλιωτικών παραγόντων. Εξαιρετικά ενδιαφέρον χαρακτηριστικό της chi70 είναι η απόλυτη ανθεκτικότητα στο φυσικό, γενικό αναστολέα χιτινολυτικής ενεργότητας, την αλλοζαμιδίνη. Η χιτινάση chi70 είναι μία ενδοχιτινάση με μεγάλο εύρος υποστρωμάτων. Παρουσιάζει, έτσι χαμηλή ειδικότητα υποστρώματος, αφού έχει την ικανότητα να υδρολύει μία ποικιλία φυσικών πολυμερών υποστρωμάτων, αλλά και συνθετικών ολιγομερών. Εμφανίζει αξιοσημείωτη ενεργότητα έναντι της κυτταρίνης, αλλά και άλλων διμερών συνθετικών υποστρωμάτων, με υπομονάδες γλυκόζης, αντί Ν-ακέτυλο-γλυκοζαμίνης. Τα χαρακτηριστικά αυτά υποστηρίζουν την άποψη ότι το ένζυμο διαθέτει δύο διακριτά ενεργά κέντρα, ένα για την υδρόλυση της χιτίνης και άλλων χιτινωδών υποστρωμάτων, και το δεύτερο για την υδρόλυση της κυτταρίνης και άλλων συγγενικών υποστρωμάτων. Τα προτιμώμενα υποστρώματα, όπως προσδιορίστηκαν βάσει των κινητικών παραμέτρων Vmax, Km και Kcat, είναι η κολλοειδής χιτίνη, μεταξύ των φυσικών υποστρωμάτων και το τριμερές της χιτίνης (η ρΝΡ-diacetylchitobiose), μεταξύ των συνθετικών υποστρωμάτων. Η σημασία της χιτινάσης chi70 προκύπτει από τα ακόλουθα μοναδικά χαρακτηριστικά: είναι η πρώτη φυσική χιτινάση που απομονώνεται και χαρακτηρίζεται από αρχαιοβακτήρια, η πρώτη μεμβρανική χιτινάση που μελετάται από οποιοδήποτε οργανισμό και η μόνη που συνδυάζει την υψηλότερη, μέχρι στιγμής, θερμοσταθερότητα, με εξαιρετική χημική σταθερότητα και ανθεκτικότητα σε γενικούς και ειδικούς αναστολείς. Προς την κατεύθυνση της απομόνωσης γονιδίου χιτινάσης, κατασκευάστηκε σημαντικός αριθμός χρωμοσωμικών βιβλιοθηκών, με βάση το χρωμοσωμικό DNA του αρχαιοβακτηρίου, το οποίο κλωνοποιήθηκε στο γνωστό φαγικό φορέα XZapII. Οι βιβλιοθήκες αυτές μετατράπηκαν, στη συνέχεια, σε φαγεμιδικές και κατόπιν σε ένα μικτό, μαζικό πληθυσμό πλασμιδίων. Ακολούθησε ανίχνευση πιθανών κλώνων χιτινάσης, αλλά και χιτοβιάσης, στις διάφορες μορφές βιβλιοθηκών, με τη χρήση ευαίσθητων υποστρωμάτων, καθώς και με εκφυλισμένους και εδικούς εκκινητές, σε αντιδράσεις PCR. Δοκιμές PCR με ειδικούς εκκινητές, σε επιλεγμένες πλασμιδιακές βιβλιοθήκες οδήγησαν στην απομόνωση και κλωνοποίηση ενός τμήματος γονιδίου χιτινάσης bp. το οποίο παρουσιάζει ισχυρή ομολογία με μεγάλο αριθμό χιτινασών, από ποικίλους οργανισμούς, αλλά, κυρίως, με τη μοναδική μέχρι σήμερα γνωστή αρχαιοβακτηριακή χιτινάση, την πρώτη που απομονώθηκε και μελετήθηκε, σε γονιδιακό επίπεδο, από αρχαιοβακτήρια, την PKchiA από το υπερθερμόφιλο αρχαιοβακτήριο Pyrococcus kodakaraensis. Το ανωτέρω γονιδιακό τμήμα κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο μήκους 63 αμινοξέων, το οποίο επανακλωνοποιήθηκε σε κατάλληλο φορέα έκφρασης (pET-31b, Novagen). Ακολούθησε υπερέκφραση του ανασυνδυασμένου γονιδίου σε επιλεγμένο στέλεχος Ε. coli [BLR(DE3)pLysS] και παραγωγή μεγάλης ποσότητας καθαρού πεπτιδίου, αναγκαίας για μια σειρά ανοσοποιήσεων σε κουνέλι. Με τη χρήση του πολυκλωνικού αντισώματος διερευνήθηκε η πιθανή ανοσοχημική σχέση του πεπτιδίου αυτού με άλλες χιτινάσες και διαπιστώθηκε ότι το αντίσωμα αναγνωρίζει τόσο την μεμβρανική (αρχαιοβακτηριακή) χιτινάση chi70, όσο και την ευβακτηριακή χιτινάση chiA από τη Serratia marcescens. Συνεπώς, το πεπτίδιο αυτό είναι δυνατό να αποτελεί τμήμα της πρωτείνης chi70, αλλά είναι εξίσου πιθανό να συνιστά μια διακριτή χιτινάση, που κωδικοποιείται, είτε από διαφορετικό γονίδιο, ή και από το ίδιο γονίδιο με εναλλακτικό τρόπο μετα-μεταγραφικής ή μετα-μεταφραστικής ωρίμανσης.