ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΕ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ

Abstract

Ο ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΠΟΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΥΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΤΟΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΤΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ ΔΕΝ ΕΧΕΙ ΚΑΤΑΝΟΗΘΕΙ ΕΠΑΡΚΩΣ. ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΣΑΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ-ΜΟΝΤΕΛΟ ΤΗΝ ΕΝΔΟΓΕΝΩΣ ΠΟΛΥΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΜΕΝΗ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΦΩΣΒΙΤΙΝΗ, ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΑΜΕ ΝΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΟΥΜΕ ΚΑΙ ΝΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΟΥΜΕ ΤΙΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ ΑΠΟ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ ΠΟΥ ΑΠΟΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΥΝ ΚΑΤΑ ΠΡΟΤΙΜΗΣΗ ΠΟΛΥΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΜΕΝΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ. ΑΝΑΠΤΥΞΑΜΕ ΜΙΑ ΑΠΛΗ ΚΑΙ ΕΥΑΙΣΘΗΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΩΝ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΠΡΑΣΙΝΟ ΤΟΥ ΜΑΛΑΧΙΤΗ. ΔΥΟ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΕΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗΣ ΤΗΣ ΦΩΣΒΙΤΙΝΗΣ, ΠΟΥ ΑΠΟΚΑΛΟΥΝΤΑΙ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗ ΤΗΣ ΦΩΣΒΙΤΙΝΗΣ 1 ΚΑΙ 2 (PVP1 ΚΑΙ PVP2), ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΑΝ ΑΠΟ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΗΚΑΝ. ΚΑΙ ΟΙ ΔΥΟ ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ ΑΠΟΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΥΝ ΕΠΙΣΗΣ (I) ΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗ A, (II) ΤΙΣ Α ΚΑΙ Β ΥΠΟΜΟΝΑΔΕΣ ΤΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ ΤΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ, (III) ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΕΤΑΙ ΜΕ ΜΙΚΡΟΣΩΛΗΝΙΣΚΟΥΣ Τ, (IV) ΤΗΝ ΚΑΖΕΙΝΗ, ΚΑΙ (V) ΤΑ ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΦΩΣΦΟΠΕΠΤΙΔΙΑ RRATVA ΚΑΙ RRREEETEEEAA ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΕΙΝΑΙ ΔΙΑΠΙΣΤΩΜΕΝΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΓΙΑ ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ, ΟΧΙ ΟΜΩΣ ΚΑΙ ΓΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΕΣ ΟΞΙΝΕΣ ΚΑΙ ΑΛΚΑΛΙΚΕΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ. Η ΜΙΚΡΟΚΥΣΤΙΝΗ LR, ΕΝΑΣ ΙΣΧΥΡΟΣ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑΣ ΤΩΝ PP-1 ΚΑΙ PP-2A, ΑΝΑΣΤΕΛΛΕΙ ΔΡΑΣΤΙΚΑ ΤΙΣ PVP1ΚΑΙ PVP2. ΟΙ PVP1 ΚΑΙ PVP2 ΑΠΟ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΟΥΝ ΜΟΡΙΑΚΑ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΠΟΥ ΔΙΑΦΕΡΟΥΝ ΑΠΟ ΤΙΣ ΓΝΩΣΤΕΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ.ΜΕΛΕΤΗΣΑΜΕ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΤΟΥ ΑΡΓΙΛΙΟΥ ΣΤΗΝ ΑΠΟΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΦΩΣΒΙΤΙΝΗΣ ΠΟΥ ΚΑΤΑΛΥΕΤΑΙ ΑΠΟ ΟΞΙΝΗ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗ, ΣΤΗ ΜΕΤΑΧΡΩΜΑΤΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ, ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΦΩΣΒΙΤΙΝΗΣ. (ΠΕΡΙΚΟΠΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗΣ)

THE MECHANISM OF DEPHOSPHORYLATION OF MUTIPHOSPHORYLATED PROTEINS IN THE MAMMALIAN BRAIN IS NOT WELL UNDERSTOOD. WE HAVE USED THE ENDOGENOUSLY MULTIPHOSPHORYLATED PROTEIN, PHOSVITIN, AS A MODEL SUBSTRATE AND UNDERTAKEN THE PURIFICATIONAND CHARACTERIZATION OF BRAIN PHOSPHATASES THAT PREFERENTIALLY DEPHOSPHORYLATE MULTIPHOSPHORYLATED PROTEINS. WE HAVE DEVELOPED A SIMPLE AND SENSITIVE COLORIMETRIC ASSAY FOR PROTEIN PHOSPHATASE ACTIVITY USING A MALACHITE GREEN PROCEDURE. TWO PHOSVITIN PHOSPHATASE ACTIVITIES, TERMED PHOSVITIN PHOSPHATASE 1 AND2 (PVP1 & PVP2), WERE ISOLATED FROM RAT BRAIN AND CHARACTERIZED. BOTH PHOSPHATASES DEPHOSPHORYLATE ALSO (I) PHOSPHORYLASE A, (II) THE Α AND Β SUBUNITS OF PHOSPHORYLASE KINASE, (III) THE MICROTUBULE-ASSOCIATED PROTEIN TAU (Τ), (IV) CASEIN, AND (V) THE SYNTHETIC PHOSPHOPEPTIDES RRATVA AND RRREEETEEEAA WHICH ARE DEFINED SUBSTRATES FOR PROTEIN PHOSPHATASES BUT NOT FOR NONSPECIFIC ACID OR ALKALINE PHOSPHATASES. MICROCYSTIN LR, A POTENT ENZYME-DIRECTED INHIBITOR OF PP-1AND PP-2A, DRASTICALLY INHIBITS PVP1 AND PVP2. BRAIN PVP1 AND PVP2 DISPLAY MOLECULAR AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS DISTINCT FROM THE KNOWN PROTEIN PHOSPHATASES. THE EFFECTS OF ALUMINUM IONS ON THE DEPHOSPHORYLATION OF PHOSVITIN CATALYZED BY ACID PHOSPHATASE, ON METACHROMASIA, AND ON THE ELECTROPHORETIC MOBILITY OF PHOSVITIN WERE ALSO STUDIED. IN ALL CASES THE ACTION OF AL3+ WAS INHIBITORY IN A CONCENTRATION- AND TIME-DEPENDENT MANNER.