Μεθοδολογία στη σύνθεση πεπτιδίων. Σύνθεση επιλεγμένων πεπτιδικών τμημάτων πρωτεϊνών. Μελέτη της ανοσογονικότητας τους μετά από σύζευξη με φυσικές μεγαλοπρωτεϊνες ή επιλεγμένους συνθετικούς φορείς

Abstract

The proteins are consisted of α-aminoacids having between them an amide bond known as peptide bond. The proteins participate in most of the functions of the human organism, especially in its defence. There are two mechanisms of defence i) the natural defence system, and ii) the immune system which produces the antibodies. The production of antibodies is caused by the antigens. The antibodies have a special affinity with the antigens. This affinity includes only a certain place of the antigen which is called epitope. Proteins can play the role of antigens. Peptides and small proteins can not raise the production of antibodies by themselves but it can be achieved if they are attached to macromolecules. The most common macromolecules are big proteins such as keyhole limpet haimocyanin (KLH), bovine serra albuvine (BSA). In 1988 the dendrimeric peptides were introduced in order to replace the above macromolecules. The dendrimeric peptides are artificial proteins and they found applications in biochemical and biopharmaceutical research. All the dendrimeric peptides share a similar design of branching from a core that gives them different architectures and dendrimeric characteristics. Several variations of branched peptides have been developed which differ only in the design of the core matrix. The core of the most common type of dendrimeric contains two or three levels of branched lysines. The dendrimeric peptides have found applications as immunogens, antigens for diagnostics and inhibitors of cell attachment. Recently a new type of multilysinic peptide introduced. The characteristic of this new molecule is the repetion of the tripeptide (Lys-Aib-Gly)n (n = 2 - 7) which gives a helical shape to the molecule. It allows the antigenic peptides to hold their original active structure, by this way is achieved a higher raise of antibody titers. In this research we compared and tested the anosogenicity of peptide dendrimers consisted of branched lysines and multiple copies of the peptide sequences 830 - 843 of tetanus toxin (T-epitope) and 101 -109 of prothymosin A (B-epitope). We concluded that these branched peptides can not be proposed as alternatives of KLH for raising high antibody titers. The SPPS is a successfully used method for the synthesis of peptides. Even if most of the problems of this method, have been solved there is one more. This problem is the incomplete aminoacylation during the coupling step. It is believed that this problem is caused due to the formation of intramolecular hydrogen bonds between the growing peptides. The problem has two obvious solutions: i) we repeat the coupling step until no unreacted amino group is 162 detected. In this case we increase the cost of the synthesis, ii) we terminate the unreacted amino group with a propere reagent. Our research focused on finding a reagent which can permanently terminate the unreacted amino group but also can make the purification with HPLC easy. We chose to synthesise a peptide whose synthesis is difficult. This peptide was H-(Ala)10-Lys-OH and we built it in four different ways: i) without the use of terminating agent, ii) with the use of acetic anhydride as terminating raegent, hi) with the use of methanesulforic acid as terminating raegent, iv) with the use of 4-phenyl benzoic acid as terminating raegent. By comparing the analytical results (MS and HPLC) of the final product we found out that 4-phenyl benzoic acid makes the purification easy but it does not terminate the unreacted amino groups. In order to increase the ractivity of our reagent we built the product of proline with 4-phenyl benzoic acid. We chose proline because we can built stable halides of this new molecule. Our reagent used as terminating reagent for the above peptide activated as: i) acylfluoride, ii) DIC, DMAP, iii) HOBT, DIC, DMAP. The study of the analytical data indicates us that we achieved our goal. Our tenninating reagent was also used for the synthesis of H-Ala-Arg-(Ala)6-Lys-OH (we wanted to see how the strong activation of the reagent effects in the guanido group), and the peptide 65-74 of ACP. Both peptides have difficulties in their synthesis. The study of the analytical data (MS, HPLC) supported our claim that this reagent can be used in SPPS as terminating reagent.

Οι πρωτεΐνες αποτελούνται από α-αμινοξέα ενωμένα μεταξύ τους με αμιδικό δεσμό, που ονομάστηκε πεπτιδικός. Οι πρωτεΐνες λαμβάνουν μέρος στις περισσότερες λειτουργίες του οργανισμού και ιδιαίτερα στην άμυνα του. Οι μηχανισμοί άμυνας του οργανισμού είναι δύο α) το φυσικό σύστημα άμυνας και β) το ανοσοποιητικό το οποίο παράγει και τα αντισώματα. Η παραγωγή των αντισωμάτων προκαλείται από τα αντιγόνα, με τα οποία έχουν μια ειδική συγγένεια. Η συγγένεια αυτή δεν αφορά όλο το αντιγόνο αλλά μια ειδική περιοχή, τον επίτοπο. Ως αντιγόνα μεταξύ άλλων μπορούν να δράσουν και οι πρωτεΐνες. Μικρές όμως πρωτεΐνες ή πεπτίδια από μόνα τους δεν προκαλούν σχηματισμό αντισωμάτων αλλά αυτό το πετυχαίνουν αν συνδεθούν με μακρομόρια. Τέτοια μακρομόρια είναι κυρίως μεγαλοπρωτεΐνες όπως η θυρεοσφαιρίνη, το ινωδογόνο, η βόειος οροαλβουμίνη (BSA), και η αιμοκυανίνη του οργανισμού Keyhole Limpet (KLH). To 1988 στη βιβλιογραφία εισήχθησαν τα δενδριμερή πεπτίδια, με σκοπό να αντικαταστήσουν τα παραπάνω μακρομόρια. Τα δενδριμερή πεπτίδια είναι μη φυσικές πρωτεΐνες, που έχουν με επιτυχία χρησιμοποιηθεί σε βιοχημικές και βιοφαρμακευτικές έρευνες. Όλα τα δενδριμερή πεπτίδια αποτελούνται από ένα πυρήνα που τους δίνει διαφορετικές αρχιτεκτονικές και δενδριμερή χαρακτηριστικά. Διάφορα είδη δενδριμερών έχουν αναπτυχθεί, που διαφέρουν μόνο στο σχεδιασμό της μήτρας. Ο πλέον διαδεδομένος τόπος δενδριμερούς έχει ως μήτρα διακλαδισμένες λυσίνες σε δυο ή τρία επίπεδα. Τα δενδριμερή έχουν βρει εφαρμογές ως ανοσογόνα για ανάπτυξη εμβολίων, αντιγόνα για διάγνωση ασθενειών και ως παρεμποδιστές πεπτιδίων. Πρόσφατα εμφανίσθηκε στη βιβλιογραφία ένα νέο είδος πολυλυσινικού μορίου. Το χαρακτηριστικό του νέου αυτού μορίου είναι μια επαναλαμβανόμενη τριάδα αμινοξέων (-Lys-Aib-Gly-X, (n = 2 - 7), η οποία δίνει μια ελικοειδή δομή στο πολυλυσινικό μόριο. Το νέο αυτό μόριο λόγω της δομής του επιτρέπει στα αντιγονικά πεπτίδια να διατηρούν την αρχική τους ενεργή διαμόρφωση, με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η καλύτερη αναγνώριση των αντισωμάτων που παράγονται. Στην παρούσα διατριβή προβήκαμε σε συγκριτική μελέτη και έλεγχο της ανοσογονικότητας πεπτιδικών δενδριμερών αποτελούμενων από μήτρα διακλαδισμένων λυσινών και πολλαπλά «αντίτυπα» των πεπτιδικών αλληλουχιών 830-843 της τοξίνης του τετάνου (Τ-επίτοποι) και 101-109 της προθυμοσίνης άλφα (Β-επίτοποι). Από τη μελέτη των αποτελεσμάτων της παρούσας εργασίας καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα πολυλυσινικά αυτά πεπτίδια, για το πεπτίδιο 101-109 της προθυμοσίνης άλφα, δεν μπορούν να προταθούν ως εναλλακτικοί της keyhole limpet hemocyanin φορείς πρόσδεσης επιτόπων, ικανοί να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη αντισωμάτων υψηλού τίτλου. Η μέθοδος σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση είναι μια πετυχημένη μέθοδος με την οποία έχει συντεθεί ένας μεγάλος αριθμός πεπτιδίων. Αν και τα περισσότερα προβλήματα που παρουσίασε η μέθοδος από την εισαγωγή της από το Merrifield , έχουν σήμερα επιλυθεί υπάρχει ακόμη ένα που περιμένει λύση και αφορά κυρίως πεπτίδια με δύσκολες αλληλουχίες. Το πρόβλημα αυτό είναι οι ατελείς αντιδράσεις που συμβαίνουν τόσο κατά το στάδιο της σύζευξης του εισερχόμενου αμινοξέος με την ελεύθερη αμινομάδα της αναπτυσσόμενης πεπτιδικής αλυσίδας όσο και κατά την αποπροστασία της α-αμινομάδας στην Fmoc-στρατηγική. Το πρόβλημα πιστεύεται ότι οφείλεται στην ύπαρξη διαμοριακών δεσμών υδρογόνου μεταξύ των αναπτυσσόμενων πεπτιδικών αλυσίδων. Στην παρούσα διατριβή ασχοληθήκαμε ιδιαίτερα με τις ατελείς συζεύξεις στο στάδιο της σύζευξης του εισερχόμενου αμινοξέος. Για το πρόβλημα αυτό υπάρχουν δύο προφανείς λύσεις: α) Επανάληψη της σύζευξης μέχρι να μην ανιχνεύουμε ελεύθερη αμινομάδα. Στην περίπτωση αυτή οι αυξημένοι χρόνοι αντίδρασης ενέχουν τον κίνδυνο της ρακεμίωσης. Επίσης με τον τρόπο αυτό αυξάνεται σε μεγάλο βαθμό το κόστος, β) Η ελεύθερη αμινομάδα να δεσμεύεται μόνιμα με κατάλληλο δραστικό αντιδραστήριο. Η έρευνα μας επικεντρώθηκε στην εύρεση ενός αντιδραστηρίου που να δεσμεύει μόνιμα την ελεύθερη αμινομάδα αλλά και να επιτρέπει τον εύκολο καθαρισμό του επιθυμητού πεπτιδίου με HPLC. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε να συνθέσουμε ως πεπτίδιο ένα πεπτίδιο το οποίο είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι παρουσιάζει προβλήματα κατά τη σύνθεση του. Το πεπτίδιο αυτό είναι το H-(Ala)i0-Lys-OH. Το πεπτίδιο συντέθηκε με τέσσερις τρόπους: ί) χωρίς χρήση αντιδραστηρίου τερματισμού, ii) με χρήση οξικού ανυδρίτη ως αντιδραστηρίου τερματισμού που είναι το πλέον χρησιμοποιούμενο, iii) με χρήση μεθανοσουλφονυλοχλωριδίου και τέλος iv) με διφαινυλοβενζοϊκό οξύ. Με σύγκριση των φασμάτων μάζας και χρωματογραφημάτων HPLC που λάβαμε για το καθένα είδαμε ότι το διφαινυλοβενζοϊκό οξύ πληροί τον όρο της ευκολίας καθαρισμού του επιθυμητού πεπτιδίου με HPLC, όμως δεν δεσμεύει πλήρως τις αμινομάδες που δεν έχουν αντιδράσει. Στη συνέχεια, για να αυξήσουμε τη δραστικότητα του αντιδραστηρίου παρασκευάσαμε το παράγωγο της προλίνης με το οξύ. Η επιλογή της προλίνης μας δίνει τη δυνατότητα να παρασκευάσουμε σταθερά ακυλοχλωρίδια και φθορίδια του παραγώγου αυτού. Έτσι το αντιδραστήριο τερματισμού ενεργοποιήθηκε ως: i) ακυλοαλογονίδιο (φθορίδω), ii) με DIC, DMAP, iii) HOBt, DIC, DMAP. Από τη μελέτη των αναλυτικών αποτελεσμάτων (φάσματα μάζας και χρωματογραφήματα HPLC) προέκυψε ότι το επιθυμητό αποτέλεσμα το πετύχαμε με ενεργοποίηση του παραγώγου της προλίνης με το διφαινυλοβενζοϊκό οξύ με HOBt, DIC, DMAP. Στη συνέχεια και για να ενισχύσουμε περαιτέρω τον ισχυρισμό μας ότι το αντιδραστήριο αυτό είναι κατάλληλο για τη σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση συνθέσαμε το πεπτίδιο H-Ala-Arg-(Ala)6-Lys-OH ώστε να μελετήσουμε πιθανή επίδραση του αντιδραστηρίου στη γουανιδομάδα της αργινίνης, και το πεπτίδιο της ACP που γνωρίζουμε από τη βιβλιογραφία ότι παρουσιάζουν δυσκολίες κατά τη σύνθεση τους. Και στα πεπτίδια αυτό το αντιδραστήριο μας έδωσε τα αναμενόμενα αποτελέσματα όπως προκύπτει από τη μελέτη των αναλυτικών αποτελεσμάτων.