Bacteriophage interactions with marine pathogenic vibrios

Abstract

Incidents of Vibrio-associated diseases in marine aquaculture are increasingly reported on aglobal scale, incited also by the world’s rising temperature. Administration of antibiotics hasbeen the most commonly applied remedy used for facing vibriosis outbreaks, giving rise toconcerns about development and spreading of antibiotic resistant bacteria in the environment.Bacteriophage therapy, constitutes a potent alternative not only for treatment but also forprevention of vibriosis in aquaculture and the current thesis addresses the potential andchallenges of using phages to control Vibrio pathogens. The combinatory administration ofvirulent bacteriophages φSt2 and φGrn1, isolated against Vibrio alginolyticus significantlyreduced the Vibrio load in cultures of Artemia salina live prey, decreasing subsequently the riskof a vibriosis outbreak in the marine hatchery. During infection, the phages φSt2 and φGrn1 alsohijack and reprogram the host metabolic machinery in order to meet their augmented demandsfor energy and nucleotide biosynthesis. Their lytic efficacy combined with their ability tomanipulate the host’s energy production mechanisms, render them ideal candidates for phagetherapy applications. Lytic phage vB_VspP_pVa5 that has been isolated against the rapidlyemerging pathogen V. splendidus is also a promising candidate for phage therapy applicationaccording to its gene content and in vitro performance against its host. The genetic features ofvB_VspP_pVa5 provide also a better insight to the evolution and genomic composition of theN4-like Vibriophages, a rather unexplored phage genus. Vibriophages are the natural predatorsof Vibrios responsible for shaping their communities in nature, however, only lytic phagesobligately lead to the death of the bacterial host after infection; hence the whole phage therapyconcept is relied on lytic phages. However, the wide presence of lysogeny in Vibrios dictates thehigh importance of temperate phages as well, primarily in driving bacterial evolution.Genetically similar Vibriophages, designated as H20-like phages, have been isolated against V.anguillarum as free phages and also identified as prophages in V. anguillarum genomes. Theirwidespread presence suggests a mutualistic interaction between this group of specific phages andtheir Vibrio hosts on a global scale. Current PhD thesis represents a multifaceted approach tostudying the interactions between marine pathogenic Vibrio and their correspondingbacteriophages, while discussing the potential and limitations of phage therapy application in thebiological control of vibriosis.

Τα περιστατικά ασθενειών που σχετίζονται με βακτήρια του γένους Vibrio στις θαλάσσιες υδατοκαλλιέργειες αναφέρονται με αυξανόμενη συχνότητα παγκοσμίως, εν μέρει λόγω της ανόδου της παγκόσμιας θερμοκρασίας. Η χορήγηση αντιβιοτικών αποτελεί την πιο συνηθισμένη αντιμετώπιση των εξάρσεων δονακίωσης, εγείροντας ωστόσο ανησυχίες για την ανάπτυξη και εξάπλωση ανθεκτικών στα αντιβιοτικά βακτηρίων στο περιβάλλον. Η φαγοθεραπεία αποτελεί μια δυναμική εναλλακτική λύση, όχι μόνο για τη θεραπεία αλλά και για την πρόληψη της δονακίωσης στις υδατοκαλλιέργειες, και η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματεύεται τις δυνατότητες και τις προκλήσεις της χρήσης φάγων για τον έλεγχο παθογόνων Vibrio.Η συνδυαστική χορήγηση των λυτικών βακτηριοφάγων φSt2 και φGrn1, που απομονώθηκαν έναντι του Vibrio alginolyticus, μείωσε σημαντικά το βακτηριακό φορτίο Vibrio σε καλλιέργειες ζωντανής λείας Artemia salina, μειώνοντας κατά συνέπεια τον κίνδυνο εξάρσεων δονακίωσης σε θαλάσσιους ιχθυογεννητικούς σταθμούς. Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, οι φάγοι φSt2 και φGrn1 καταλαμβάνουν και επαναπρογραμματίζουν τον μεταβολικό μηχανισμό του ξενιστή, προκειμένου να καλύψουν τις αυξημένες ανάγκες τους σε ενέργεια και βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων. Η λυτική τους αποτελεσματικότητα σε συνδυασμό με την ικανότητά τους να χειρίζονται τους μηχανισμούς παραγωγής ενέργειας του ξενιστή τους καθιστά ιδανικούς υποψήφιους για εφαρμογές φαγοθεραπείας.Ο λυτικός φάγος vB_VspP_pVa5, που απομονώθηκε έναντι του ταχέως αναδυόμενου παθογόνου V. splendidus, αποτελεί επίσης υποσχόμενο υποψήφιο για εφαρμογή φαγοθεραπείας, βάσει τόσο της γονιδιακής του σύστασης όσο και της in vitro απόδοσής του έναντι του ξενιστή του. Τα γενετικά χαρακτηριστικά του vB_VspP_pVa5 παρέχουν επίσης βαθύτερη κατανόηση της εξέλιξης και της γονιδιωματικής σύστασης των N4-like βακτηριοφάγων, ενός σχετικά ανεξερεύνητου γένους φάγων.Οι βακτηριοφάγοι έναντι των βακτηρίων του γένους Vibrio, αποτελούν τους φυσικούς τους θηρευτές και διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη διαμόρφωση των κοινοτήτων τους στη φύση. Ωστόσο, μόνο οι λυτικοί φάγοι οδηγούν αναπόφευκτα στον θάνατο του βακτηριακού ξενιστή μετά τη μόλυνση· ως εκ τούτου, η έννοια της φαγοθεραπείας στηρίζεται αποκλειστικά σε λυτικούς φάγους. Παρ' όλα αυτά, η ευρεία παρουσία λυσιγονίας στα Vibrio υπογραμμίζει τη σημασία και των ήπιων φάγων, κυρίως ως κινητήριων δυνάμεων της βακτηριακής εξέλιξης.Γενετικά παρόμοιοι βακτηριοφάγοι, γνωστοί ως H20-like φάγοι, έχουν απομονωθεί έναντι του V. anguillarum ως ελεύθεροι φάγοι και έχουν επίσης ταυτοποιηθεί ως προφάγοι σε γονιδιώματα V. anguillarum. Η ευρεία παρουσία τους υποδηλώνει μια αμοιβαίως ωφέλιμη αλληλεπίδραση μεταξύ αυτής της ομάδας φάγων και των ξενιστών Vibrio σε παγκόσμιο επίπεδο.Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπροσωπεί μια πολύπλευρη προσέγγιση στη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ θαλάσσιων παθογόνων Vibrio και των αντίστοιχων βακτηριοφάγων τους, ενώ παράλληλα συζητά τις δυνατότητες και τους περιορισμούς της εφαρμογής φαγοθεραπείας στον βιολογικό έλεγχο της δονακίωσης.

Forekomsten af Vibrio-associerede sygdomme i akvakultur er stigende, bla som et resultat af stigende havtemperatur. Anvendelse af antibiotika er den mest anvendte metode til at behandle udbrud af vibriose udbrud, men denne metode er forbundet med risiko for udvikling og spredning af antibiotikaresistente bakterier i miljøet. Bakteriofag-terapi udgør potentielt et effektivt alternativ til antibiotika, ikke kun i behandling af vibriose men også i forebyggelse af sygdomsudbrud, og nærværende afhandling adresserer fordele og udfordringer ved at anvende af fager til at kontrollere Vibrio patogener. Kombineret tilførsel af bakteriofagerne φSt2 and φGrn1, der var isoleret mod Vibro alginolyticus resulterede i en signifikant reduktion i forekomsten af Vibrio bakterier i kulturer af vandloppen Artemia salina. Artemia bruge som føde i fiskeopdræt og denne reduktion mindsker dermed risikoen for vibriose udbrud. Ved infektion af bakterien, overtager og omprogrammerer bakteriofagerne φSt2 and φGrn1 også værtscellens metaboliske apparat for at dække deres behov for energi og produktion. Deres lytiske effektivitet og evne til at manipulere deres værts energiproduktion, gør dem til ideelle kandidater til anvendelse i terapeutisk behandling af Vibrio bakterier. Den lytiske bakteriofag vB_VspP_pVa5 som er isoleret mod den hyppigt forekommende patogen V. splendidus er også en lovende kandidat til bakterifag-terapi på baggrund af analyser af dens genetiske indhold evne til at kontrollere sin værtsbakterier under laboratorieforhold. Desuden giver de genetiske karakteristika ved vB_VspP_pVa5 ny viden om evolution og genetisk sammensætning af en gruppe af uudforskede vibriofager, N4-lignende fager. Vibriofagerne er naturlige predatorer på Vibrio bakterier og bidrager på den måde til at forme sammensætning af de mikrobielle samfund i naturen. Det er dog kun de lytiske fager der medfører at den bakterielle vært dør som følge af infektionen, og derfor er det kun de lytiske fager der kan anvendes til fag-terapi. Ikke desto mindre, understreger den udbredte forekomst af lysogeni i Vibrio bakterier den store betydning af temperate fager for evolutionen af marine Vibrio. Genetisk ensartede vibriofager, kaldet H20-lignende fager, blev dels isoleret mod V. anguillarum, som frie fager og dels identificeret som profager i V. anguillarum genomer. Deres store udbredelse indikerede en mutualistisk interaktion mellem de specifikke bakteriofager og deres Vibrio værter der på global scala. Nærværende PhD afhandling repræsenterer en mangesidig tilgang til at studere interaktioner mellem marine Vibrio patogener og deres bakteriofager, og en diskussion af potentialet og begrænsningerne ved at anvende bakteriofager til at kontrollere vibriose.