Το Vibrio harveyi στην Ελληνική ιχθυοκαλλιέργεια: παθογένεια, συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση και βιολογικό κόστος της προσαρμογής στα αντιβιοτικά

Abstract

Vibriosis is one of the most important diseases affecting Mediterranean aquaculture. It has been known for over two centuries and affects a wide range of marine organisms, including fish, mollusks (such as mussels, oysters, and other gastropods), and crustaceans (such as shrimp, lobsters, and crabs). Despite extensive research aimed at controlling the disease, it remains a major threat to aquaculture, causing substantial economic losses, particularly in the farming of fish and shrimp. Initially, vibriosis was attributed to Vibrio anguillarum, considered the primary etiological agent. However, recent studies have implicated additional opportunistic Vibrio species in the onset of the disease.This dissertation investigated outbreaks of vibriosis in Greek aquaculture, focusing on the epidemiology and species diversity of the genus Vibrio. Key findings include the seasonal occurrence of infections, the frequent co-isolation of multiple species, notably Vibrio harveyi alongside Photobacterium damselae subspecies, and the emergence of the disease in new host species. It was evident that during spring, vibriosis involved a greater diversity of Vibrio species, while in summer and autumn, V. harveyi was the dominant isolate. A comparative genomic analysis was conducted on 21 V. harveyi strains isolated from vibriosis outbreaks, with a focus on the pangenome, phylogeny, virulence factors, and antigenic proteins. The strains exhibited high phenotypic plasticity, which was reflected in high genomic plasticity, as revealed by the analysis. Key virulence determinants were conserved among the strains, including secretion systems (T2SS, T3SS, T4SS, T6SS), heme transporters, siderophores, and toxins such as tlh, vhha, hlyIII, tlyC, and rtx. Shared resistance genes were also detected, including blaCARB-17, which is associated with ampicillin resistance observed in all isolates. The most conserved antigenic proteins were TolC, OmpK, OmpW, and OmpA, outer membrane proteins that are typical of Vibrio spp. and represent promising vaccine targets. Furthermore, an adaptive evolution experiment was designed with V. harveyi and three antibiotics widely used in aquaculture: florfenicol, oxytetracycline, and oxolinic acid. The resulting resistant bacterial lines were studied to explore the biological cost of the development of resistance. Adaptation to antibiotics resulted in the accumulation of mutations that were not randomly distributed throughout the genome but concentrated on chromosome 1. Mutations were identified in genes associated with resistance mechanisms for each antibiotic, as well as in genes of ribosomal proteins, transcriptional regulators, and subunits of the ATPase complex. Adaptation to oxolinic acid was associated with reduced growth rate, prolonged lag phase, and diminished virulence. Proteomic analysis of this group revealed downregulation of HemF that is involved in heme biosynthesis, structural and functional changes in membrane-associated systems, such as upregulation of SecD in the T2SS and suppression of key T6SS components ClpV and Hcp, reduced abundance of ATPase complex proteins, and disruption of proteostasis and ribosomal function. These findings indicate that resistance to oxolinic acid is linked to the activation of stress response mechanisms that compromise growth and virulence. Overall, V. harveyi exhibits remarkable ecological and genetic adaptability, reinforcing its role as a major aquaculture pathogen. It can rapidly evolve antibiotic resistance through chromosomal mutations and transcriptional regulation. This study significantly advances our understanding of the evolutionary potential of V. harveyi under selective pressure in the aquaculture environment.

Η δονακίωση αποτελεί μια από τις σημαντικότερες ασθένειες της Μεσογειακής ιχθυοκαλλιέργειας. Πρόκειται για μια ασθένεια γνωστή εδώ και περισσότερους από δύο αιώνες, προσβάλλει ποικιλία οργανισμών, όπως ψάρια, μαλάκια (μύδια, στρείδια και άλλα γαστερόποδα), και καρκινοειδή (γαρίδες, αστακούς και καβούρια). Παρά την εκτενή έρευνα για την αντιμετώπιση της, εξακολουθεί να θεωρείται η σημαντικότερη στην υδατοκαλλιέργεια, και ενέχει πολύ μεγάλες οικονομικές απώλειες, αθροιστικά για την καλλιέργεια ψαριών και γαρίδας. Αρχικά, η δονακίωση αποδιδόταν στο Vibrio anguillarum, το οποίο θεωρούνταν ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας της. Σήμερα, ωστόσο, άλλα ευκαιριακά παθογόνα του γένους Vibrio σχετίζονται επίσης με την πρόκληση της ασθένειας. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν περιστατικά δονακίωσης στην Ελληνική ιχθυοκαλλιέργεια, εστιάζοντας στην επιδημιολογία και την ποικιλότητα βακτηρίων του γένους Vibrio. Η εποχικότητα των λοιμώξεων, η συναπομόνωση πολλών ειδών, όπως το Vibrio harveyi με υποείδη του Photobacterium damselae, καθώς και η εμφάνιση της νόσου σε νέους ξενιστές, αποτέλεσαν σημαντικά ευρήματα της έρευνας. Κατά τη μελέτη των περιστατικών κατέστη εμφανές ότι την άνοιξη η ασθένεια σχετιζόταν με μεγαλύτερη ποικιλότητα ειδών του γένους Vibrio, ενώ τους καλοκαιρινούς και φθινοπωρινούς μήνες κυριαρχούσε ως απομόνωση το V. harveyi. Πραγματοποιήθηκε συγκριτική γονιδιωματική 21 στελεχών V. harveyi που είχαν απομονωθεί από περιστατικά δονακίωσης, δίνοντας έμφαση στο πανγονιδίωμα, τη φυλογένεση, τους λοιμογόνους παράγοντες και τις αντιγονικές πρωτεΐνες. Παρατηρήθηκε ότι διάφορα στελέχη του V. harveyi εμφάνισαν υψηλή φαινοτυπική πλαστικότητα, η οποία αντικατοπτριζόταν και σε υψηλή γονιδιωματική πλαστικότητα, όπως διαπιστώθηκε από τη συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση. Σημαντικοί λοιμογόνοι παράγοντες ήταν κοινοί σε όλα τα στελέχη, μεταξύ αυτών είναι τα εκκριτικά συστήματα T2SS, T3SS, T4SS, T6SS, μεταφορείς της αίμης, σιδηροφόρα, διάφορες τοξίνες οι tlh, vhha, hlyIII, tlyC, rtx. Ανιχνεύτηκαν γονίδια ανθεκτικότητας που επίσης ήταν κοινά μεταξύ των 21 στελεχών και μεταξύ αυτών, το blaCARB-17 σχετίζεται με την ανθεκτικότητα στην αμπικιλλίνη, η οποία παρατηρήθηκε σε όλα τα στελέχη. Οι πιο συντηρημένες αντιγονικές πρωτεΐνες στα στελέχη φάνηκαν να είναι οι TolC, OmpK, OmpW, OmpA που θεωρούνται τυπικά συντηρημένες στα Vibrio και αποτελούν καλούς στόχους για την παραγωγή εμβολίων. Επιπλέον, σχεδιάστηκαν πειράματα προσαρμοστικής εξέλιξης του V. harveyi σε τρία αντιβιοτικά (φλορφενικόλη, οξυτετρακυκλίνη, οξολινικό οξύ), τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στην υδατοκαλλιέργεια. Τα βακτήρια που απέκτησαν ανθεκτικότητα μελετήθηκαν ώστε να απαντηθούν ερωτήματα που σχετίζονται με το βιολογικό κόστος της ανάπτυξης ανθεκτικότητας για το μικροοργανισμό. Η προσαρμογή του V. harveyi στα τρία αντιβιοτικά προκάλεσε μεταλλάξεις που δεν κατανέμονταν τυχαία στο γονιδίωμα του, αλλά συσσωρεύτηκαν στο χρωμόσωμα 1. Παρατηρήθηκαν μεταλλάξεις σε γονίδια που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα στο εκάστοτε αντιβιοτικό και επίσης σε γονίδια ριβοσωμικών πρωτεϊνών, ρυθμιστών της γονιδιακής έκφρασης, και σε γονίδια των υπομονάδων της ATPάσης. Η προσαρμογή στο οξολινικό οξύ επέφερε μείωση στο ρυθμό αύξησης, παράτεινε τη φάση lag και συνεπαγόταν με μείωση της λοιμογόνου ικανότητας του βακτηρίου. Μέσω πρωτεομικής ανάλυσης σε αυτήν την ομάδα, διαπιστώθηκαν η καταστολή του HemF, που συμμετέχει βιοσύνθεση της αίμης, δομικές και λειτουργικές αλλαγές στα συστήματα μεμβρανών όπως η ενίσχυση της SecD του T2SS και η καταστολή βασικών συστατικών του T6SS, των ClpV και Hcp. Επίσης, παρατηρήθηκε μείωση των πρωτεϊνών του συμπλόκου της ATPάσης και διαταραχή της πρωτεόστασης και της ριβοσωμικής λειτουργίας. Συνοψίζοντας, έγινε εμφανές ότι η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στο οξολινικό οξύ συνδέεται με την ενεργοποίηση μηχανισμών απόκρισης σε περιβαλλοντικό στρες που σχετίζονται με τη μειωμένη αύξηση και λοιμογονικότητα. Το V. harveyi παρουσιάζει υψηλή οικολογική και γενετική ευελιξία, γεγονός που ενισχύει τη θέση του ως σημαντικό παθογόνο στην υδατοκαλλιέργεια. Το είδος μπορεί να αναπτύξει ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά ταχύτατα μέσω χρωμοσωμικών μεταλλάξεων και ρύθμισης της μεταγραφής. Η μελέτη αυτή συμβάλλει ουσιαστικά στην κατανόηση του εξελικτικού δυναμικού του είδους υπό συνθήκες επιλεκτικής πίεσης στο περιβάλλον της υδατοκαλλιέργειας.