Σύνθεση, χαρακτηρισμός και μελέτη της βιολογικής δραστικότητας πολυπυρηνικών οργανομεταλλικών συμπλόκων του ρουθηνίου

Abstract

Chemotherapy is largely based on the interaction of molecules with DNA, inhibiting cell proliferation. The binding of these compounds to DNA can be covalent or non-covalent. Many complex compounds have been applied in this context, with the most notable example being cisplatin, which was the first approvedmetal-based anticancer drug back in 1974. Cisplatin’s binding to DNA takes place covalently, after the hydrolysis of the complex and the formation of an adduct with N7 of guanine, resulting in cell apoptosis. Despite its widespread use, and that of its derivatives, cisplatin does not target cancer cells, causing serious side effects. In addition, a large percentage of patients who are given cisplatin develop drug-resistance, resulting in reduced effectiveness. Therefore, there is a need for new chemotherapeutic agents, possibly with a different mode of action in order to overcome these issues. An alternative to complexes that bind covalently to DNA are those that act non-covalently. The two main ways of non-covalent binding with DNAare intercalation, which includes the insertion of a molecule between two adjacent DNA bases, and groovebinding. These interactions result in a change of the structure of the DNA double helix and, consequently,cell apoptosis, a process that is beneficial in the fight against cancer. The first non-covalent DNA binderswere organic molecules, but inorganic complexes have also attracted significant interest, as they offer important advantages, such as the fact that the metal center holds the ligands, that are the ones bindingwith DNA, in possibly favorable positions. In this context, Ru(II) complexes have attracted considerable interest. In addition, it has been shown that small molecules’ ability to bind to DNA can be significantly improved by introducing a second functional unit capable of interacting with DNA, thus leading to increased cytotoxicity. Based on the above, new dinuclear and mononuclear Ru(II)-arene complexes with oligopyridine ligands and saturated coordination sphere were synthesized and characterized with the following general formulas:{[Ru(cym)(L1)]2(μ-BLi)}2+, {[Ru2(cym)2(L1)(L2)](μ-BLi)}3+, {[Ru(cym)(L1)]2(μ-BLi)}4+ and [Ru(cym)(L1)(BLi)]2+(cym = p-cymene, L1 or L2 = ppy-H+ or bzq-H+ or phen (Image Ι) and BLi = BL1 - BL5 (Image Ι)). The chelatin gligands determine the overall charge of the complex. 2D NMR (NOESY) was used to study the structural characteristics of the complexes. Furthermore, for {[Ru(cym)(bzq-H+)]2(μ-BLi)}(PF6)2 (where BLi = BL1, BL2,BL3), suitable crystals for X-ray crystallography were isolated and studied. The above complexes interactions with B type oligonucleotides d(5′-CGCGCG-3′)2, d(5′-CTTTTGCAAAAG3′)2 and d(5′-CGCGAATTCGCG-3′)2, as well as with Calf Thymus DNA (CT DNA), were studied the nuclearmagnetic resonance spectroscopy (NMR) and through fluorescence quenching experiments with ethidiumbromide (EB). Using these techniques, it was possible to draw conclusions about the complexes’ binding strength towards DNA, and also to correlate this with the total charge and also with the rigidity and the length of the BL. All complexes were found to bind non-covalently with DNA, through a mix of bindingmodes, such as intercalation, grove binding, electrostatic interactions. The Stern-Volmer constant (KSV) and binding constant (Kb) were also calculated. Finally, cytotoxic assessment studies were also conducted, against the cell lines MCF-7, A2780 and A2780cis-res, from which the IC50 values were calculated. These studies proved a moderate selectivity for cancer cells for the studied complexes.

Η χημειοθεραπεία βασίζεται εν πολλοίς στην αλληλεπίδραση μορίων με το DNA, αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Η δέσμευση των ενώσεων αυτών στο DNA μπορεί να είναι ομοιοπολική ή μη ομοιοπολική. Στο συγκεκριμένο πεδίο έχουν βρει εφαρμογή πολλές σύμπλοκες ενώσεις, με χαρακτηριστικότερο παράδειγμα το cisplatin, το οποίο είναι το πρώτο εγκεκριμένο αντικαρκινικό φάρμακο βασισμένο σε μέταλλο (metal based drug), ήδη από το 1974. Η δέσμευσή του στο DNA είναι ομοιοπολική, μετά από υδρόλυσή του και σχηματισμό προϊόντος προσθήκης με το Ν7 της γουανίνης, και έχει ως συνέπεια την απόπτωση του κυττάρου. Παρά την ευρεία του χρήση, και αναλόγων του, δεν έχει στόχευση προς τα καρκινικά κύτταρα, προκαλώντας σοβαρές παρενέργειες. Επίσης, μεγάλο ποσοστό των ασθενών στους οποίους χορηγείται cisplatin αναπτύσσουν ανθεκτικότητα έναντι του φαρμάκου, με αποτέλεσμα την μείωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Ως εκ τούτου, έχει προκύψει η ανάγκη για νέα χημειοθεραπευτικά, με διαφορετικό τρόπο δράσης, τα οποία θα ξεπερνούν τα παραπάνω ζητήματα. Μια εναλλακτική των συμπλόκων που δεσμεύονται ομοιοπολικά στο DNA, είναι αυτά που δρουν μη ομοιοπολικά. Δύο από τους κυριότερους τρόπους μη ομοιοπολικής δέσμευσης στο DNA είναι η παρεμβολή μεταξύ δύο γειτονικών βάσεων (intercalation) και η δέσμευση στις αύλακες (groove binding) μέσω υδρόφοβων ή ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, δεσμών υδρογόνου ή με συνδυασμό των παραπάνω. Αποτέλεσμα των παραπάνω αλληλεπιδράσεων είναι η μεταβολή της δομής της διπλής έλικας του DNA και η κατά συνέπεια κυτταρική απόπτωση, διεργασία η οποία είναι ωφέλιμη στην καταπολέμηση του καρκίνου. Οι πρώτες ενώσεις που δρουν μέσω μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων ήταν οργανικάμόρια, ωστόσο σημαντικό ενδιαφέρον έχουν προσελκύσει και τα σύμπλοκα, καθώς προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως για παράδειγμα ότι το μεταλλικό κέντρο συγκρατεί τους υποκαταστάτες του σε θέσεις πιθανώς ευνοϊκές για την αλληλεπίδραση με το DNA. Στο πλαίσιο αυτό, μεγάλο ενδιαφέρον έχουν συγκεντρώσει τα σύμπλοκα του Ru(II). Επιπροσθέτως, έχει αποδειχθεί ότι η ικανότητα δέσμευσης μικρών μορίων με το DNA, μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά από την εισαγωγή μιας δεύτερης λειτουργικής μονάδας, ικανή για αλληλεπίδραση με το DNA, οδηγώντας έτσι σε αυξημένη κυτταροτοξικότητα. Με βάση τα παραπάνω, απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν νέα διπυρηνικά και μονοπυρηνικά σύμπλοκα του Ru(II) με p-cymene και ολιγοπυριδινικούς υποκαταστάτες με κορεσμένη σφαίρα ένταξης μετους εξής γενικούς τύπους: {[Ru(cym)(L1)]2(μ-BLi)}2+, {[Ru2(cym)2(L1)(L2)](μ-BLi)}3+, {[Ru(cym)(L1)]2(μ-BLi)}4+και [Ru(cym)(L1)(BLi)]2+ (cym = p-cymene, L1 ή L2 = ppy-H+ ή bzq-H+ ή phen (Εικόνα Ι) και BLi = BL1 - BL5(Εικόνα Ι)). Οι χηλικοί υποκαταστάτες L1 και L2 είναι αυτοί που καθαρίζουν και το συνολικό φορτίο του συμπλόκου. Μέσω 2D NMR (NOESY) εξάχθηκαν συμπεράσματα σχετικά με τη χωρική διευθέτηση τωνυ ποκαταστατών των συμπλόκων. Επιπλέον, για τα {[Ru(cym)(bzq-H+)]2(μ-BLi)}(PF6)2 (όπου BLi = BL1, BL2,BL3) ήταν εφικτή η απομόνωση κατάλληλων κρυστάλλων για τη μελέτη τους με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Όλα τα παραπάνω σύμπλοκα μελετήθηκαν ως προς την αλληλεπίδρασή τους με τα αλληλοσυμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια Β τύπου d(5′-CGCGCG-3′)2, d(5′-CTTTTGCAAAAG-3′)2 καιd(5′-CGCGAATTCGCG-3′)2, καθώς επίσης και με Calf Thymus DNA (CT DNA), μέσω φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και μέσω πειραμάτων ανταγωνιστικής πρόσδεσης - απόσβεσης φθορισμού με βρωμιούχο αιθίδιο (ΕΒ), από όπου αντλήθηκαν συμπεράσματα ως προς τον τρόπο και την ισχύ της δέσμευσης τους στο DNA, καθώς επίσης και συσχετισμός αυτής με το μήκος και την ευκαμψία του BL αλλά και με το συνολικό φορτίο του συμπλόκου. Τα σύμπλοκα βρέθηκε ότι αλληλεπιδρούν μη ομοιοπολικά με το DNA μέσω διαφόρων τρόπων, όπως παρεμβολή, δέσμευση στις αύλακες και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, ενώ υπολογίστηκαν και οι σταθερές Stern-Volmer (KSV) και πρόσδεσης(Kb). Επίσης, πραγματοποιήθηκαν και κυτταροτοξικές μελέτες έναντι των κυτταρικών σειρών MCF-7,A2780, A2780cis-res, από όπου βρέθηκαν τα IC50 και αποδείχθηκε η ύπαρξη ενδιάμεσης εκλεκτικότητας προς τα καρκινικά κύτταρα έναντι των υγειών.