Μεμβρανική ρευστότητα των πολυμορφοπύρηνων κυττάρων στα νεογνά και παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου

Abstract

The aim of the present study was to assess the membrane fluidity of neonatal polymorphonuclears (PMNs) and to study the effects of fluidity alterations to the PMNs oxidative metabolism. The PMNs we have studied derived from venous blood from healthy fullterm neonates, 3-5 days old, cord blood from healthy full term pregnancies and venous blood from healthy adults as controls. The formyl peptide FMLP 10⁻⁷M was used as a PMN stimulus. Employing a steady-state fluorescence polarization method we found that the fluid state of the membrane of PMNs from neonates was significantly less than that of adult controls. Ethanol significantly increased the fluidity of the cell membranes of neonatal PMNs. Oxygen metabolism was assessed by O₂ production and luminol dependent chemiluminescence (L-CL). Cord blood PMNs produced decreased amount of O₂ compared to neonatal PMNs and even less amount of O₂ was produced by adult PMNs. Although neonatal PMNs produced more O₂ than the adult PMN, in high concentrations of stimulus (FMLP 10⁻⁶Μ) the rate of increment of O₂ production in neonatal cells was much lower than from adult PMNs (p<0.05). Neonatal PMNs produced less LCL than adult PMNs. After the addition of aliphatic alcohol neonatal PMNs produced less amount of O₂ and L-CL. The above findings suggest that the increase of membrane fluidity causes a decrease in O₂ production and an even more decrease of the LCL which is already low in neonatal PMNs. These results may have important clinical significance: It is possible that drugs altering the membrane fluidity of neonatal PMNs may increase or decrease the bactericidal capacity of PMNs and consequently the resistance of neonates to infections. The modification of PMNs functions, so that these cells could become more effective in coping with infections, is the aim of recent research. However when one is dealing with neonatal PMNs should be aware of the very complex immunological mechanisms in neonates and any modification of the PMN function should be introduced only after careful consideration of these mechanisms.

Η μελέτη αυτή επιχειρεί να συμβάλει στην προσπάθεια διερεύνησης της λειτουργίας των νεογνικών ουδετεροφίλων πολυμορφοπύρηνων (ΠΜΠ) τα οποία είναι απαραίτητα για την αντιμετώπιση των μικροβιακών και μυκητιασικών λοιμώξεων του νεογνού. Η κατανόηση των μηχανισμών αυτών έχει μεγάλη κλινική σημασία διότι ενδεχομένως παρέχει είτε τη δυνατότητα χορήγησης φαρμακευτικών ουσιών οι οποίες μπορεί να βελτιώσουν την αμυντική ικανότητα των ΠΜΠ είτε την αποφυγή άλλων που έχουν αντίθετο αποτέλεσμα. Βασική λειτουργία των ΠΜΠ είναι η μικροβιοκτονία. Αυτή επιτυγχάνεται με τη συνδυασμένη δράση διαφόρων ενζύμων (που απελευθερώνονται από τα διάφορα κοκκία των ΠΜΠ) και των ελευθέρων ριζών οξυγόνου, που παράγονται κατά την ενεργοποίηση του ΠΜΠ από μικρόβια ή χημειοτακτικούς παράγοντες.Υπεύθυνο για την παραγωγή των ελευθέρων ριζών οξυγόνου είναι ένα ένζυμο (NADPH-οξειδάοη) που βρίσκεται στη μεμβράνη του ΠΜΠ και είναι αδρανές σε μη ενεργοποιημένα κύτταρα. Το ένζυμο αυτό καταλύει την αντίδραση της αναγωγής του οξυγόνου σε ρίζα υπεροξειδίου (O₂]. Η ρίζα αυτή αποτελεί τη μητρική πρόδρομη ουσία όλων των άλλων ελευθέρων ριζών οξυγόνου [υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η₂O₂), ρίζα υδροξυλίου (OH), οξυγόνο απλής κατάστασης (¹O₂), υποχλωριώδες οξύ (OCT), χλωραμίνες κ.α.]. Η μικροβιοκτόνος ικανότητα των ΠΜΠ εξαρτάται από τη λειτουργία ενός σημαντικού αριθμού πρωτεϊνών (υποδοχείς-ένζυμα) που βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη των ΠΜΠ. Μεταβολές στη φυσικοχημική κατάσταση της μεμβράνης αυτής (δηλαδή μεταβολές στη ρευστότητα της μεμβράνης) είναι δυνατόν να επηρεάσουν τη λειτουργικότητα των παραπάνω πρωτεϊνών και κατ' επέκταση τη μικροβιοκτονία των ΠΜΠ. Σκοπός της μελέτης αυτής είναι να εκτιμηθεί η ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης του ΠΜΠ του νεογνού και να μελετηθεί η επίδραση των μεταβολών της ρευστότητας στην παραγωγή ελευθέρων ριζών O₂. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ΠΜΠ φλεβικού αίματος υγιών τελειομήνων νεογνών ηλικίας 3-5 ημερών καθώς και ΠΜΠ αίματος ομφαλίου λώρου. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ΠΜΠ φλεβικού αίματος υγιών ενηλίκων. Αξίζει να σημειωθεί ότι στις λίγες ανάλογες μελέτες της βιβλιογραφίας ως ΠΜΠ νεογνών θεωρούνται τα ΠΜΠ του ομφαλίου λώρου. Στην παρούσα μελέτη θεωρήσαμε σκόπιμο να μελετήσουμε ξεχωριστά τα ΠΜΠ των νεογνών και τα ΠΜΠ του ομφαλίου λώρου. Τα ΠΜΠ διαχωρίστηκαν από το ολικό αίμα μετά από καθίζηση με δεξτράνη και επιστοίβαξη σε Ficoll-Hypaque. Για την ενεργοποίηση των ΠΜΠ χρησιμοποιήθηκε το χημειοπεπτίδιο π-φορμυλ-μεθειονυλλευκυλ-φαινυλαλανίνη (FMLP) σε αραίωση 10⁻⁷Μ στο τελικό διάλυμα. Το χημειοπεπτίδιο αυτό αποτελεί συνθετικό προϊόν ανάλογο με τις φυσικές χημειοτακτικές ουσίες που απεκκρίνονται από τα μικρόβια. Στη διατριβή αυτή: α. Μελετήθηκε αρχικά η παραγωγή 02 " από τα ΠΜΠ με τη μέθοδο της αναγωγής του κυτοχρώματος α Βρέθηκε ότι νεογνικά ΠΜΠ παράγουν περισσότερο O₂ από τα ΠΜΠ του ομφαλίου λώρου (p<0.01) και πολύ περισσότερο από εκείνα των ενηλίκων (p<0.01). Το εύρημα τούτο καταρρίπτει την υπόθεση που είχε διατυπωθεί από άλλους ερευνητές (οι οποίοι είχαν μελετήσει μόνο κύτταρα ομφαλίου λώρου και ενηλίκων) ότι η αυξημένη παραγωγή O₂ από τα κύτταρα του ομφαλίου λώρου (σε σύγκριση με τα κύτταρα του ενήλικα) οφείλεται στο ότι ο τοκετός "πριμοδοτεί" (prime) τα κύτταρα του ομφαλίου λώρου που αυξάνουν έτσι την παραγωγή O₂. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας πιθανώς δείχνουν ότι ενδογενείς παράγοντες του κυττάρου (ανωριμότητα μηχανισμών) ευθύνονται για την αυξημένη παραγωγή O₂ από τα νεογνικά ΠΜΠ και όχι εξωγενείς παράγοντες όπως ο τοκετός. β. Προκειμένου να διερευνηθεί αν η παραγωγή O₂ από τα ΠΜΠ των νεογνών επηρεάζεται από τη συγκέντρωση των χημειοπεπτιδίων (όπως συμβαίνει με τα ΠΜΠ των ενηλίκων) ελέγχθηκε η παραγωγή O₂ σε διάφορες συγκεντρώσεις FMLP. Βρέθηκε ότι σε υψηλές συγκεντρώσεις (FMLP 10⁻⁶ Μ) η αύξηση της παραγωγής O₂ από τα νεογνικά ΠΜΠ είναι μικρότερη αυτής των ενηλίκων (p<0.05). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι οι εφεδρείες των ΠΜΠ των νεογνών σε μια βαρειά λοίμωξη είναι ελαττωμένες συγκριτικά με αυτές των ενηλίκων. γ. Στη συνέχεια μετρήθηκε η χημειοφωταύγεια που εκπέμπεται κατά την ενεργοποίηση με FMLP 10⁻⁷M των ΠΜΠ νεογνών και ενηλίκων. Η χημειοφωταύγεια είναι μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρύτατα για την εκτίμηση της παραγωγής ελευθέρων ριζών O₂. Η μεγίστη τιμή της εκπεμπόμενης χημειοφωταύγειας είναι ανάλογη της βακτηριοκτόνου ικανότητας του ΠΜΠ. Στη μελέτη μας βρέθηκε ότι η παραγωγή ελευθέρων ριζών O₂ από τα ΠΜΠ των νεογνών, είναι χαμηλότερη αυτής των ενηλίκων. Από τα αποτελέσματα αυτά φαίνεται ότι μολονότι τα ΠΜΠ των νεογνών παράγουν αυξημένα ποσά O₂, η παραγωγή ελευθέρων ριζών O₂ με μικροβιοκτόνο δράση είναι ελαττωμένη. Τούτο πιθανώς οφείλεται στο γεγονός ότι η παραγωγή μικροβιοκτόνων ελευθέρων ριζών όπως το OCT και το OH απαιτεί, εκτός από την παραγωγή O₂, τη συμμετοχή και άλλων ενζύμων όπως η μυελοπεροξειδάση και η λακτοφερρίνη αντίστοιχα τα οποία είναι γνωστό ότι ποσοτικά ανεπαρκούν στα νεογνά. Το εύρημα αυτό της μελέτης μας είναι συμβατό με τη μειωμένη μικροβιοκτόνο ικανότητα που ως γνωστό εμφανίζουν τα νεογνικά ΠΜΠ. δ. Στη συνέχεια ελέχθηκε η επίδραση των μεταβολών της ρευστότητας των κυτταρικών μεμβρανών στη λειτουργία των ΠΜΠ. Η ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης των ΠΜΠ μετρήθηκε με τη μέθοδο της πολωμένης φθορίζουσας ακτινοβολίας και με ιχνηθέτη την 1,6 διφαινυλοεξατριένη (DPH). Η ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης των ΠΜΠ των νεογνών βρέθηκε μικρότερη αυτής των ενηλίκων (p<0,01). Τέλος τα ΠΜΠ νεογνών και ενηλίκων υποβλήθηκαν στην επίδραση αλειφατικής αλκοόλης (αιθανόλης) η οποία έχει ρευστοποιό δράση στις κυτταρικές μεμβράνες. Μετά την επίδραση της αλκοόλης: 1) Αυξήθηκε η ρευστότητα των κυτταρικών μεμβρανών και των ΠΜΠ νεογνών και των ΠΜΠ των ενηλίκων και δεν βρέθηκε διαφορά στη ρευστότητα μεταξύ των μεμβρανών των ΠΜΠ νεογνών και ενηλίκων. 2) Μειώθηκε η παραγωγή O₂ σε σχέση με την προ της επίδρασης της αλκοόλης κατάσταση και από τα ΠΜΠ των νεογνών (p<0,05) ) και από τα ΠΜΠ των ενηλίκων (p<0,01). Συμπερασματικά φαίνεται ότι η αύξηση της ρευστότητας της κυτταρικής μεμβράνης των ΠΜΠ των νεογνών, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της παραγωγής O₂ από τα κύτταρα αυτά και τη μείωση της ήδη ελαττωμένης παραγωγής ελευθέρων ριζών O₂ με μικροβιοκτόνο δράση. Τούτο έχει ασφαλώς μεγάλη κλινική σημασία διότι υποδηλώνει ότι η χορήγηση στα νεογνά φαρμακευτικών ουσιών που μεταβάλλουν τη ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης είναι δυνατόν να επηρεάσει την μικροβιοκτόνο ικανότητα των κυττάρων αυτών. Η τροποποίηση των λειτουργιών του ΠΜΠ κάθε ηλικίας ούτως ώστε τούτο να καταστεί πιο αποτελεσματικό στην καταπολέμηση των μικροβίων αποτελεί σήμερα στόχο εκτεταμένης έρευνας. Εφόσον όμως πρόκειται για ΠΜΠ νεογνού θα πρέπει να ληφθεί υπόψιν ότι στον ήδη πολύπλοκο ανοσολογικό μηχανισμό των ενηλίκων, στα νεογνά υπεισέρχονται και πολλοί άλλοι παράγοντες που έχουν σχέση με την ανωριμότητα του ανοσοβιολογικού τους συστήματος και οποιαδήποτε παρέμβαση θα πρέπει να γίνεται με γνώμονα την ιδιαιτερότητα αυτή.