Διάχυση διαφόρων αντιβιοτικών διαμέσου της εξωκυττάριας βλεννοπολυσακχαρίδης ("slime") των κοαγκουλάση - αρνητικών σταφυλόκοκκων

Abstract

The extracellular mucopolysaccharide substance (slime), which is produced by certain strains of coagulase-negative staphylococci, has been recently recognized as an important virulence factor. Slime is responsible for infections caused by the above strains to patients with implanted foreign-bodies. Furthermore, it is accountable for antibiotic-treatment failures concerning device-related infections. This thesis investigated the influence of slime substance on the activity of all currently used antibiotics with antistaphylococcal spectrum. Two different in vitro semiquantitative methods were developed for this purpose. Twenty-six clinical and 2 standard isolates of slime-producing (according to Christensen’s method) as well as 14 clinical and 2 standard isolates of non-slime-producing coagulase-negative staphylococci were used in the first method. Forty μΙ of broth culture of each isolate were inoculated on sterile cellulose filter membranes placed on Staphylococcal No 110 agar plates. After a 24-hour incubation, filters were eluted in 3 consecutive tubes of Tryptic Soy Broth and placed on plates containing Mueller Hinton agar preseeded with Bacillus subtilis spores. Forty μΙ of the examined antimicrobial solution were inoculated on the surface of each filter. After a 24-hour incubation, inhibition zone diameters were measured and were compared to control (inhibition zone diameter produced by the diffusion of equal amount of antibiotic through a sterile filter). Results demonstrated that teicoplanin and vancomycin showed a remarkable reduction in effectiveness (29.6 and 73.5%, respectively) after diffusion through staphylococcal slime. All the other tested antibiotics showed a lower reduction in effectiveness (range: 2.5-11.8%). Diffusion through filters inoculated with non-slimeproducing strains produced a reduction in the effectiveness of rifampin, cotrimoxazole, ciprofloxacin, pefloxacin, gentamicin, erythromycin, tobramycin, amikacin, and teicoplanin (range: 0.3-3.6%). The second method, which is described for the first time in literature, was designed for the same purpose. Twenty-six clinical and 2 standard isolates of slime-producing coagulase-negative staphylococci were used. Sterile cellulose filter membranes placed on Staphylococcus No 110 agar plates were inoculated with 40 μΙ of broth culture of each isolate. After a 24-hour incubation, filters were eluted in 3 consecutive tubes of Tryptic Soy Broth and slime from each membrane was collected and dissolved in 40 μΙ of the examined antimicrobial solution. This suspension was inoculated in Mueller Hinton agar wells preseeded with Bacillus subtilis spores. After incubation, inhibition zones were measured and compared to control (inhibition zone produced by equal amount of antibiotic without slime). Comparison demonstrated that pefloxacin, teicoplanin and vancomycin showed a remarkable reduction in effectiveness (30, 51.7, and 66.8%, respectively). Conversely, rifampin, clindamycin and the macrolides showed the lowest reduction in effectiveness (0.8-2.3%). The presence of slime reduced the effectiveness of the other antimicrobial agents from 4 to 16.1 %. The results of the present study may help clinicians to rationally select the most effective antimicrobial agent for the eradication of infections of prosthetic devices caused by slime-producing strains of coagulase-negative staphylococci.

Η εξωκυττάρια βλεννοπολυσακχαριδική ουσία (slime), που παράγεται από πολλά στελέχη κοαγκουλάοη-αρνητικών σταφυλόκοκκων, έχει αναγνωρισθεί τα τελευταία χρόνια ως σημαντικός λοιμογόνος παράγοντας, υπεύθυνος για την πρόκληση δυσίατων λοιμώξεων από τα μικρόβια αυτά σε ασθενείς που φέρουν ξένα σώματα. Η ουσία αυτή ενοχοποιείται για την συχνή αποτυχία της συντηρητικής αγωγής στη θεραπεία αυτού του είδους των λοιμώξεων. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η μεταβολή της δραστικότητας όλων των αντιβιοτικών με αντισταφυλοκοκκικό φάσμα από την παρουσία της βλεννοπολυσακχαρίδης. Για το σκοπό αυτό εφαρμόσθηκαν δύο διαφορετικές in vitro ημιποσοτικές μέθοδοι. Στην πρώτη χρησιμοποιήθηκαν 26 κλινικά και 2 πρότυπα στελέχη κοαγκουλάοη-αρνητικών σταφυλόκοκκων που παρήγαγαν βλεννοπολυσακχαρίδη (σύμφωνα με τη μέθοδο του Christensen) και 14 κλινικά και 2 πρότυπα στελέχη που δεν παρήγαγαν την ουσία αυτή. Σαράντα μΙ καλλιεργήματος σε Tryptic Soy Broth από κάθε μικρόβιο ενοφθαλμίσθηκαν στην επιφάνεια στείρων φίλτρων κυτταρίνης που είχαν τοποθετηθεί σε τρυβλία με Staphylococcus άγαρ No 110. Μετά από 24ωρη επώαση τα φίλτρα ξεπλύθηκαν σε 3 διαδοχικά δοχεία με Tryptic Soy Broth και τοποθετήθηκαν σε τρυβλία με Mueller Hinton άγαρ που είχε αναμειχθεί με σπόρους Bacillus subtilis. Στην επιφάνεια κάθε φίλτρου τοποθετήθηκε διάλυμα του υπό εξέταση αντιβιοτικού (40μΙ) και μετά από 24ωρη επώαση μετρήθηκαν οι ζώνες αναστολής στο άγαρ και συγκρίθηκαν με τον αντίστοιχο μάρτυρα, δηλαδή τη ζώνη αναστολής που δημιουργήθηκε από τη διέλευση ίσης ποσότητας αντιβιοτικού μέσω στείρου φίλτρου. Διαπιστώθηκε ότι η τεϊκοπλανίνη και η βανκομυκίνη, όταν διηθούνται μέσω φίλτρου που έχει προεπωασθεί με στέλεχος σταφυλόκοκκου που παράγει βλεννοπολυσακχαρίδη, παρουσιάζουν μείωση δραστικότητας κατά 29,6 και 73,5%, αντίστοιχα ενώ όλα τα υπόλοιπα αντιβιοτικά παρουσιάζουν μείωση δραστικότητας από 2,5 ως 11,8%. Όταν τα αντιβιοτικά διηθούνται μέσω φίλτρου που έχει προεπωασθεί με στέλεχος που δεν παράγει βλεννοπολυσακχαρίδη διαπιστώνεται ότι μείωση δραστικότητας παρουσιάζουν μόνο η ριφαμπικίνη, η κοτριμοξαζόλη, η σιπροφλοξασίνη, η πεφλοξασίνη, η γενταμικίνη, η ερυθρομυκίνη, η τομπραμυκίνη, η αμικασίνη, και η τεϊκοπλανίνη από 0,3 ως 3,6%. Στη δεύτερη μέθοδο, που περιγράφεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, χρησιμοποιήθηκαν τα 26 κλινικά και τα 2 πρότυπα στελέχη κοαγκουλάοη-αρνητικών σταφυλόκοκκων που παρήγαγαν βλεννοπολυσακχαρίδη. Στείρα φίλτρα κυτταρίνης, που είχαν τοποθετηθεί σε τρυβλία με Staphylococcus άγαρ No 110, ενοφθαλμίσθηκαν με 40 μΙ καλλιεργήματος κάθε στελέχους και επωάσθηκαν αεροβίως για 24 ώρες. Μετά από ξέπλυμα σε 3 διαδοχικά δοχεία με Tryptic Soy Broth, από την επιφάνεια κάθε φίλτρου συλλέχθηκε η βλεννοπολυσακχαρίδη και αναμείχθηκε με 40 μΙ διαλύματος του υπό εξέταση αντιβιοτικού. Το μείγμα αυτό τοποθετήθηκε σε οπές που είχαν διανοιχθεί σε τρυβλία με Mueller Hinton άγαρ, στο οποίο είχε ενσωματωθεί εναιώρημα Bacillus subtilis. Μετά από 24ωρη επώαση μετρήθηκαν οι ζώνες αναστολής και συγκρίθηκαν με τον μάρτυρα, δηλαδή τη ζώνη αναστολής που δημιουργήθηκε από ίση ποσότητα αντιβιοτικού χωρίς βλεννοπολυσακχαρίδη. Από τη σύγκριση προκύπτει ότι η πεφλοξασίνη, η τεϊκοπλανίνη και η βανκομυκίνη παρουσιάζουν αξιοσημείωτη μεταβολή της δραστικότητας τους από την παρουσία της εξωκυττάριας βλεννοπολυσακχαρίδης κατά 30, 51,7 και 66,8%, αντίστοιχα. Αντίθετα, η ριφαμπικίνη, η κλινδαμυκίνη και οι μακρολίδες παρουσιάζουν τη μικρότερη μείωση στη δραστικότητα τους (0,8-2,3%). Η παρουσία της βλεννοπολυσακχαρίδης μειώνει τη δραστικότητα των υπολοίπων αντιβιοτικών από 4 ως 16,1%. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θα βοηθήσουν τον κλινικό ιατρό στην ορθολογική επιλογή των δραστικότερων αντιβιοτικών για τη θεραπεία των λοιμώξεων των ξένων σωμάτων από στελέχη κοαγκουλάση-αρνητικών σταφυλόκοκκων, που παράγουν εξωκυττάρια βλεννοπολυσακχαρίδη.