Analysis of collagen and its peptides in chronic diseases

Abstract

Tissues consist of two major components: cells and the extracellular matrix (ECM). The latter is involved in structural integrity; regulating cell phenotype, proliferation, survival and migration; and maintaining tissue homeostasis. Of particular interest in the ECM are collagens, a family of 28 proteins, with a common triple helix left-handed polyproline II motif formed by three polypeptide chains (α chains) consisting of Gly-X-Y repeats (with X frequently being a proline and Y frequently a hydroxyproline). This PhD thesis focuses on the ECM protein found in greater abundance and largely involved in pathological conditions, type I collagen (COL (I)), which consists of two collagen type I alpha 1 (COLα1 (I)) chains and one collagen type I alpha 2 (COLα2 (I)) chain 3. COL (I) is actively involved in fibrosis, a common denominator in chronic diseases characterised by excessive ECM accumulation in tissues. Fibrosis is, as mentioned before, distinguished by an imbalance in ECM production, mostly by fibroblasts, and ECM degradation, particularly of collagens, and can occur in multiple organs. Many diseases are associated with fibrosis and inappropriate wound healing. Taking into account that 1 in 60 of the global population develops heart fibrosis, 1 in 4 develops liver fibrosis, and 1 in 6 develops renal fibrosis; that fibrosis ultimately leads to organ failure requiring transplantation; as well as a lack of treatment options other than organ transplantation, the molecular mechanisms of fibrosis are of clinical interest. Improved understanding of such mechanisms can be used in drug repurposing strategies (finding alternative uses for existing drugs, which reduces expenses and risks to bring the drug to the market, and speeds up this process). Mass spectrometry-based proteomics offers an unbiased view of disease-associated changes on the proteome level. Considering the involvement of ECM proteins in fibrosis, these are of specific interest; however, their identification and quantification using mass spectrometry is hindered by their low abundance. Therefore, in this thesis, we investigated the benefits and limits of a decellularization protocol, removing the more abundant cellular proteins which can mask the less abundant ECM proteins, followed by proteomics analysis of the tissue. Moreover, we performed a comprehensive analysis of fibrotic tissue, identifying common proteins between fibrosis in different organs, investigating the affected pathways and proposing new compounds that may aid in the treatment of fibrosis.COLα1 (I) itself induces signalling pathways through binding of various receptors, including integrin β1, Endo180, Discoidin Domain Receptor (DDR), Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1 (LAIR-1), C-X-C chemokine receptor (CXCR) 4 and CXCR2. Matrix-metalloproteinases (MMPs) and cathepsins are prominently involved in the degradation of ECM proteins, including collagens. This degradation generates peptides, some of which exhibit biological activity and are termed “matrikines”. These matrikines can circulate in blood and are detectable in urine. Their identification is facilitated by technologies such as capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry (CE-MS), a robust and reproducible high-throughput method. The biological activities of collagen-derived matrikines include, among others, ECM deposition, collagen synthesis, chemoattraction, proliferation, and inflammation. Specific motifs on these peptides, such as the DGEA motif, the GUXGEZ motif (where U is usually hydrophobic, X usually hydroxyproline, and Z is often arginine), and the PGP motif have been extensively studied and have been shown to induce cell signalling and induce specific cellular activity. However, in most of these studies, synthetic peptides containing such motifs were used at high concentrations. Naturally occurring collagen-derived peptides have been associated with conditions such as kidney, cardiovascular and liver diseases, and have been proposed as biomarkers for these disorders. Therefore, the investigation of the biological effect of such peptides is relevant to better understand these increasingly prevalent diseases. These diseases often involve compromised endothelial function and are characterised by the presence of fibrosis, which is distinguished by an imbalance in ECM production (mostly by fibroblasts) and ECM degradation. Understanding how abundant collagen peptides influence endothelial cells and fibroblasts is therefore biologically relevant and may reveal mechanisms through which these peptides impact vascular health and disease progression. Therefore, we investigated the impact of specific peptides derived from COLα1 (I) on endothelial cells and fibroblasts.

Οι ιστοί αποτελούνται από δύο κύρια δομικά στοιχεία: τα κύτταρα και την εξωκυττάρια μήτρα [(EΚM), η αγγλική συντομογραφία (ECM) θα χρησιμοποιηθεί σε αυτή τη διδακτορική διατριβή]. Η τελευταία συμβάλλει στη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας των ιστών, ρυθμίζει τον φαινότυπο, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και τη μετανάστευση των κυττάρων, ενώ διαδραματίζει καίριο ρόλο στην διατήρηση της ΕΚΜ ομοιόστασης. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα κολλαγόνα, μια οικογένεια 28 πρωτεϊνών, με κοινό μοτίβο μία αριστερόστροφη τριπλή έλικα πολυπρολίνης ΙΙ, η οποία σχηματίζεται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες (α αλυσίδες) που αποτελούνται από επαναλήψεις Gly-X-Y (με το Χ συνήθως να είναι προλίνη και το Υ υδροξυπρολίνη). Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην πρωτεΐνη της ΕΚΜ που βρίσκεται σε μεγαλύτερη αφθονία και εμπλέκεται σε μεγάλο βαθμό σε παθολογικές καταστάσεις, το κολλαγόνο τύπου Ι (COL (I)), το οποίο αποτελείται από δύο αλυσίδες κολλαγόνου τύπου Ι α1 (COLα1 (I)) και μία αλυσίδα τύπου α2 (COLα2(I)). Το κολλαγόνο τύπου Ι συμμετέχει ενεργά στην ίνωση, κοινό παρονομαστή σε χρόνιες νόσους που σχετίζονται με την υπερβολική συσσώρευση ΕΚΜ στους ιστούς. Η ίνωση, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, διακρίνεται από την συσσώρευση EΚM, κυρίως από ινοβλάστες, και από την αποικοδόμηση της EΚM, ιδιαίτερα των κολλαγόνων, και μπορεί να εμφανιστεί σε διάφορα όργανα. Πολλές ασθένειες σχετίζονται με την ίνωση και την ανεπαρκή επούλωση τραυμάτων στους ιστούς. Ενδεικτικά, 1 στους 60 ανθρώπους παγκοσμίως αναπτύσσει καρδιακή ίνωση, 1 στους 4 ηπατική ίνωση και 1 στους 6 νεφρική ίνωση. Δεδομένου, ότι η ίνωση μπορεί να οδηγήσει σε οργανική ανεπάρκεια και κατ’επέκταση σε ανάγκη μεταμόσχευσης, και δεδομένης της έλλειψης θεραπειών εκτός από τη μεταμόσχευση οργάνων, οι μοριακοί μηχανισμοί της ίνωσης παρουσιάζουν ιδιαίτερο κλινικό ενδιαφέρον. Επομένως, η περαιτέρω κατανόηση αυτών των μηχανισμών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επαναχρησιμοποίηση φαρμάκων (εύρεση εναλλακτικών χρήσεων για τα υπάρχοντα φάρμακα, η οποία μειώνει τα έξοδα και τους κινδύνους για την κυκλοφορία του φαρμάκου στην αγορά και επιταχύνει τη διαδικασία). Η ανάλυση του πρωτεώματος με βάση την τεχνική φασματομετρίας μάζας προσφέρει μια αμερόληπτη εικόνα των αλλαγών που σχετίζονται με ασθένειες σε επίπεδο πρωτεϊνών. Παρ’ όλο που η εμπλοκή των διαφόρων πρωτεϊνών της ΕΚM στην ίνωση παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, η ταυτοποίηση και η ποσοτικοποίησή τους με τη χρήση φασματογράφου μάζας παρεμποδίζεται από τη χαμηλή τους ποσότητα.Ως εκ τούτου, σε αυτή την διατριβή διερευνήθηκαν τα οφέλη και οι περιορισμοί ενός πρωτοκόλλου αποκυτταροποίησης, κατά το οποίο αφαιρούνται οι πιο συχνά εκφραζόμενες κυτταρικές πρωτεΐνες, και ακολουθεί πρωτεωμική ανάλυση του ιστού. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μία εξονυχιστική ανάλυση του ινώδους ιστού, εντοπίζοντας κοινές πρωτεΐνες μεταξύ διαφορετικών οργάνων, με σκοπό την διερεύνηση των σχετικών κυτταρικών μονοπατιών και τον εντοπισμό νέων μορίων που μπορούν να βοηθήσουν στη θεραπεία της ίνωσης. Είναι γνωστό πως η ίδια η αλυσίδα COLα1 (I) επάγει σηματοδοτικά μονοπάτια μέσω της σύνδεσης της με διάφορους υποδοχείς, συμπεριλαμβανομένων των integrin β1, Endo180, Discoidin Domain Receptor (DDR), Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1 (LAIR-1), C-X-C chemokine receptor (CXCR) 4, και CXCR2.Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της μητρας (MMPs) και οι καθεψίνες εμπλέκονται σε μεγάλο βαθμό στην αποικοδόμηση των κολλαγόνων και άλλων πρωτεϊνών της EΚM. Αυτή η αποικοδόμηση παράγει πεπτίδια, μερικά εκ των οποίων εμφανίζουν βιολογική δράση και ονομάζονται «ματρικίνες». Οι ματρικίνες μπορούν να βρεθούν στο αίμα και είναι συχνά ανιχνεύσιμες και στα ούρα. Η ταυτοποίησή τους διευκολύνεται από τεχνολογίες όπως η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση σε συνδυασμό με την τεχνική φασματομετρία μάζας (CE-MS), μια ισχυρή και αναπαράξιμη μέθοδος υψηλής απόδοσης. Οι βιολογικές δράσεις των ματρικινών που προέρχονται από τους διάφορους τύπους κολλαγόνου σχετίζονται, μεταξύ άλλων, με την εναπόθεση EΚM, τη σύνθεση κολλαγόνου, τo θετικό χημειοτακτισμό, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη φλεγμονή. Συγκεκριμένα μοτίβα σε αυτά τα πεπτίδια, όπως το μοτίβο DGEA, το μοτίβο GUXGEZ (όπου το U είναι συνήθως ένα υδρόφοβο αμινοξ΄ύ, το X υδροξυπρολίνη, και το Z αργινίνη) και το μοτίβο PGP, έχουν μελετηθεί εκτενώς και έχουν αποδειχθεί ότι επάγουν κυτταρική σηματοδότηση και δραστηριότητα. Ωστόσο, στις περισσότερες απο αυτές τις μελέτες χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά πεπτίδια που περιέχουν τέτοια μοτίβα σε υψηλές συγκεντρώσεις. Τα φυσικώς απαντώμενα πεπτίδια που προέρχονται από τους διάφορους τύπους κολλαγόνου έχουν συσχετιστεί με διαταραχές όπως νεφρικές, καρδιαγγειακές και ηπατικές νόσους και έχουν προταθεί ως πιθανοί βιοδείκτες για τη διάγνωση ή/και την παρακολούθησή τους. Κατ’ επέκταση, η διερεύνηση της βιολογικής δράσης τέτοιων πεπτιδίων είναι σημαντική για την κατανόηση αυτών των ολοένα και πιο διαδεδομένων ασθενειών. Αυτές οι ασθένειες συχνά σχετίζονται με μειωμένη ενδοθηλιακή λειτουργία και χαρακτηρίζονται από την παρουσία ίνωσης, η οποία οφείλεται στην συσσώρευση EΚM (κυρίως από ινοβλάστες) καθώς και στην αποικοδόμηση της EΚM. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο αυτά τα πεπτίδια κολλαγόνου επηρεάζουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τους ινοβλάστες είναι επομένως βιολογικά σημαντική και μπορεί να αναδείξει μηχανισμούς μέσω των οποίων επηρεάζουν την αγγειακή λειτουργία και την εξέλιξη νοσημάτων. Ως εκ τούτου, στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η επίδραση συγκεκριμένων πεπτιδίων που προέρχονται από την αλυσίδα COLα1 (I) στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τους ινοβλάστες.