Διερεύνηση της αποτελεσματικότητας και ασφάλειας της in vitro ωρίμανσης ωαρίων σε κύκλους εξωσωματικής γονιμοποίησης

Abstract

Oocyte in vitro maturation (IVM) is an assisted reproductive technique that corresponds to minimal or no ovarian stimulation, making it suitable for a specific group of patients. More specifically, this may include women with polycystic ovary syndrome (PCOS), as well as patients who are about to undergo gonadotoxic therapy, for whom fertility preservation without further hormonal load is indicated. The use IVM is valuable for the above-mentioned patient groups, but fertility specialists should carefully select the cases to be subjected to this technique, otherwise IVM may be considered as an add-on technique, as described in the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) guidelines for fertility preservation in women. It is also worth noting that IVM has not yet been shown to be as effective as a traditional IVF cycle, in terms of clinical pregnancy and live birth rates, while concerns have been raised about the long-term safety of this technique.As a result, both safety and efficacy of the technique remain controversial, making it necessary to collect new scientific data to draw clear conclusions and guidelines that will lead to safer use of the technique in clinical practice.In the present PhD study, a total of 55 cases were recruited and followed the IVM and Rescue IVM protocols. More specifically, 25 IVM cases were initially recruited, of which 20 started an IVM cycle, while 15 proceeded to oocyte retrieval and in 12 patient cases oocytes were retrieved. A total of 53 oocytes were collected, of which 69.8% were mature. The mean mature oocyte count was higher in the control group (3.53 ± 2.67), compared to the IVM group (2.47 ± 1.92), but no statistically significant difference was recorded (p = 0.220). The fertilization rate in the IVM group reached 54.7%, with the number of fertilized eggs (2PN) being higher in the control group (3.00 ± 2.33) compared to the IVM (1.93 ± 1.53), but with no statistically significant difference (p = 0.150). The total number of embryos in the IVM group was 16, at a rate of 30.2%. More specifically, a slightly higher number of developing embryos was observed in the control group (2.27 ± 1.79) versus IVM (1.67 ± 1.29), with no17significant difference (p = 0.302). The percentage of developing embryos was higher in the control group (72.78%), compared to IVM (65.00%), without statistical significance (p = 0.610). The control group showed a higher mean number of blastocysts (1.33 ± 1.23), compared to the IVM group (0.69 ± 0.86). However, this difference was not statistically significant (p = 0.128). Comparison of the number of good quality embryos between the two groups did not show a statistically significant difference (p = 0.416). In total, 10 embryo transfers were performed, of which 3 were beta-hCG positive (30% success), and one birth was recorded (10% success per embryo transfer and 1.9% on the initial number of oocytes). In the VMcontrol group (same women in a previous cycle), 105 oocytes were collected, with a maturation rate of 50.5% and a fertilization rate of 36.2%. In total, 22 embryos were created (20.9%), 12 embryo transfers were performed with 4 positive beta-hCG tests (33.3%), but no births occurred. The correlation test between the applied method and beta-hCG outcome by Fisher's Exact Test resulted in p = 1.000. No statistically significant difference was found in terms of beta-hCG positivity, between the two groups.In the Rescue IVM group, 30 cases were initially recruited, of which 25 started a cycle, 20 proceeded to oocyte retrieval and in 18 cases, oocytes were collected. A total of 180 oocytes were collected, with a maturation rate of 41.83% MII at oocyte retrieval, whereas a maturation rate of 46.47% of MI and GV becoming MII, after the Rescue IVM, therefore with an overall maturation rate of 88.3%. The fertilization rates at oocyte retrieval, before Rescue IVM were 20,56%, whereas after Rescue IVM were 34,44%, so that the total, before and after Rescue IVM, fertilization rates were 55%. Concerning the number of mature oocytes, the Rescue IVM group had a mean value of 4.55 with a standard deviation of 3.15, while the control group had a higher mean value of 5.90 with a standard deviation of 3.52. This difference was not statistically significant (p=0.209). However, the percentage of mature oocytes showed a statistically significant difference (p=0.024), with the control group achieving a higher percentage (57.78%), compared to the Rescue IVM group (46.47%). The fertilization rate reached 55%, leading to the generation of 57 embryos (31.7%), although the number of fertilized eggs was higher in the control group (3.90 vs. 3.00), but the difference was not statistically significant (p=0.203). The percentage of developing embryos was 86.69% in the control group and 77.74% in the Rescue IVM group, again with no statistically significant difference (p=0.371). The percentage of blastocysts showed almost similar values between the two groups (52.36% for the control group and 50.74% for the Rescue IVM group), with no statistical difference (p=0.857). Finally, in terms of good quality embryos, the Rescue IVM group showed a slightly higher mean (1.85) compared to the control group18(1.70), but the difference was not significant (p=0.705).In total, 23 embryo transfers were performed, of which 9 were successful in terms of pregnancy (39.1%), with 6 final births (26.1% per embryo transfer and 3.3% on the initial number of oocytes), corresponding to 5 live births and 1 birth with intrauterine death, due to Poland syndrome. In the Rescue IVM control group (same women in a previous cycle) 204 oocytes were collected, with a maturation rate of 57.8% and fertilization rate of 38.2%. In total, 46 embryos were created (22.6%) and 19 embryo transfers were performed. Four positiveβ-hCG tests and 1 miscarriage were recorded, but no successful birth. Statistical analysis using the Pearson Chi-Square test, showed that the difference between the two groups is not statistically significant (χ² = 1.758, df = 1, p = 0.185), in terms of pregnancy rates. Although it appears that there is a higher success rate in the Rescue IVM group (45%), compared to the Control group (25%), this difference is not statistically significant. Based on the results of the study, the Rescue IVM group showed the highest success rates in terms of both fertilization and births, while the Control IVM group showed the lowest rates of maturity and generated embryos.Overall, the effect of in vivo hCG on Rescue IVM cases seems to lead to better results than those of classical IVM with in vitro hCG effect, but the statistical difference is not significant due to the relatively small number of cases that managed to be recruited to the end of the study. Indeed, protocols of conventional ovarian stimulation lead to higher numbers of collected oocytes, as well as better maturation rates and consequently higher numbers of good quality embryos.To conclude, IVM has not yet proven to be as effective as conventional IVF protocols, in terms of clinical pregnancy rates andlive birth rates. Concerns have also been raised regarding the safety of the method, as well as the long-term safety of IVM and additional data are needed to conclude for its safety and effectiveness. IVM is a promising technique for a specific group of patients, but its efficacy and safety remain under investigation, with further scientific studies being essential to confirm these findings.Key-words: oocyte in vitro maturation, clinical pregnancy, live birth, oocyte, effectiveness, safety, laboratory, assisted reproductive technologies, add-on techniques

Η in vitro ωρίμανση των ωαρίων (in vitro maturation of oocytes, IVM) αποτελεί μια τεχνική υποβοηθούμενης αναπαραγωγής που αντιστοιχεί σε ελάχιστη ή απουσία διέγερσης ωοθηκών, καθιστώντας την κατάλληλη για μία συγκεκριμένη ομάδα ασθενών. Πιο ειδικά, αυτή μπορεί να περιλαμβάνει γυναίκες με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (polycystic ovary syndrome, PCOS), καθώς επίσης και ασθενείς που πρόκειται να υποβληθούν σε γοναδοτοξική θεραπεία, στις οποίες ενδείκνυται η διατήρηση γονιμότητας χωρίς περαιτέρω ορμονική επιβάρυνση. Η χρήση της τεχνικής IVM είναι πολύτιμη για τις προαναφερθείσες ομάδες ασθενών, ωστόσο οι ειδικοί γονιμότητας πρέπει να επιλέγουν με προσοχή τα περιστατικά που θα υποβάλλονται στην τεχνική αυτή, διότι σε αντίθετη περίπτωση η τεχνική IVM μπορεί να θεωρηθεί επιπρόσθετη τεχνική (αdd-on technique), όπως περιγράφεται στις κατευθυντήριες οδηγίες της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Ανθρώπινης Αναπαραγωγής (European Society of Human Reproduction and Embryology, ESHRE) για τη διατήρηση γονιμότητας στις γυναίκες. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η μέθοδος IVM δεν έχει αποδειχθεί ακόμη εξίσου αποτελεσματική όσο ένας κλασικός κύκλος εξωσωματικής γονιμοποίησης, σε ό,τι αφορά τα ποσοστά εγκυμοσύνης και γεννήσεων, ενώ ταυτόχρονα έχουν εκφραστεί ανησυχίες για τη μακροπρόθεσμη ασφάλεια της τεχνικής αυτής. Ως αποτέλεσμα, τόσο η ασφάλεια αλλά και η αποτελεσματικότητα της τεχνικής IVM παραμένουν αμφιλεγόμενες, κάνοντας απαραίτητη τη συλλογή νέων επιστημονικών δεδομένων για τη διεξαγωγή σαφών συμπερασμάτων και νέων κατευθυντήριων που θα οδηγήσουν στην ασφαλέστερη χρήση της τεχνικής σε κλινική πράξη. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή στρατολογήθηκαν συνολικά 55 περιστατικά ασθενών που εντάχθηκαν στα πρωτόκολλα IVM (n=25) και Rescue IVM (n=30). Πιο ειδικά, στρατολογήθηκαν αρχικά 25 περιστατικά IVM, εκ των οποίων 20 ξεκίνησαν IVM κύκλο εξωσωματικής, 15 προχώρησαν σε ωοληψία, ενώ σε 12/15 περιστατικά ανευρέθησαν ωάρια. Συλλέχθηκαν συνολικά 53 ωάρια, το ποσοστό ωρίμανσης ανήλθε σε 69.8% και το ποσοστό γονιμοποίησης 54.7%. Δημιουργήθηκαν 16 έμβρυα (30.2)%, έγιναν 10 εμβρυομεταφορές με 3 θετικά τεστ β-hCG (30%) και καταγράφηκε 1 γέννηση. Στην αντίστοιχη ομάδα ελέγχου για το IVM (ίδιες γυναίκες σε προηγούμενο κύκλο), συλλέχθηκαν 105 ωάρια, με ποσοστό ωρίμανσης 50,5% και γονιμοποίησης 36,2%. Δημιουργήθηκαν 22 έμβρυα (20,9%), έγιναν 12 εμβρυομεταφορές με 4 θετικά τεστ β-hCG (33,3%), αλλά δεν υπήρξε καμία γέννηση.14 Η μέση τιμή του αριθμού ώριμων ωαρίων ήταν υψηλότερη στην ομάδα ελέγχου (3,53 ± 2,67) σε σύγκριση με την ομάδα IVM (2,47 ± 1,92), χωρίς ωστόσο να καταγράφεται στατιστικά σημαντική διαφορά (p = 0,220). Ο αριθμός γονιμοποιημένων ωαρίων (2PN) ήταν μεγαλύτερος στην ομάδα ελέγχου (3,00 ± 2,33) σε σχέση με το IVM (1,93 ± 1,53), χωρίς όμως στατιστικά σημαντική διαφορά (p = 0,150). Παρατηρήθηκε ελαφρώς υψηλότερος αριθμός αναπτυσσόμενων εμβρύων στην ομάδα ελέγχου (2,27 ± 1,79) έναντι του IVM (1,67 ± 1,29), χωρίς σημαντική διαφορά (p = 0,302). Αντίστοιχα, το ποσοστό αναπτυσσόμενων εμβρύων ήταν υψηλότερο στην ομάδα ελέγχου (72,78%) έναντι του IVM (65,00%), χωρίς στατιστική σημαντικότητα (p = 0,610). Η ομάδα ελέγχου εμφάνισε μεγαλύτερο μέσο αριθμό βλαστοκύστεων (1,33 ± 1,23) συγκριτικά με την ομάδα IVM (0,69 ± 0,86). Ωστόσο, η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,128). Η σύγκριση του αριθμού καλής ποιότητας εμβρύων μεταξύ των δύο ομάδων δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p = 0,416). Ο έλεγχος συσχέτισης μεταξύ της εφαρμοζόμενης μεθόδου και του αποτελέσματος της χοριακής με Fisher’sExactTest έδωσε p = 1,000. Δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς την θετικότητα της β-hCG, μεταξύ των δύο ομάδων. Στην ομάδα έρευνας Rescue IVM, στρατολογήθηκαν αρχικά 30 περιστατικά, εκ των οποίων 25 ξεκίνησαν κύκλο Rescue IVM, 20 προχώρησαν σε ωοληψία και στα 18 ανευρέθησαν ωάρια. Συλλέχθηκαν συνολικά 180 ωάρια, το ποσοστό ωρίμανσης ωαρίων ΜΙΙ στην ωοληψία ήταν 41,83% και το ποσοστό των ΜΙ και GV που ωρίμασαν σε ΜΙΙ, μετά το Rescue IVM ήταν 46,47%, ήτοι συνολικό ποσοστό ωρίμανσης 88.3%. Tα ποσοστά γονιμοποίησης στην ωοληψία, πριν Rescue IVM ήταν 20,56%, ενώ μετά το Rescue IVM ήταν 34,44%, ώστε το συνολικό πριν και μετά Rescue IVM ποσοστό γονιμοποίησης ήταν 55%. Δημιουργήθηκαν 57 έμβρυα (31.7%), πραγματοποιήθηκαν 23 εμβρυομεταφορές (συνδυαστικά πριν και μετά το rescue), εκ των οποίων 9 ήταν επιτυχείς ως προς την κύηση (39,1%), με 6 τελικά γεννήσεις (26,1% ανά εμβρυομεταφορά), οι οποίες αντιστοιχούν σε 5 γεννήσεις φυσιολογικών τέκνων και 1 γέννηση με ενδομήτριο θάνατο λόγω συνδρόμου Poland. Στην ομάδα ελέγχου για το Rescue IVM (ίδιες γυναίκες σε προηγούμενο κύκλο) συλλέχθηκαν 204 ωάρια, με ποσοστό ωρίμανσης 57,8% και γονιμοποίησης 38,2%. Δημιουργήθηκαν 46 έμβρυα (22,6%) και πραγματοποιήθηκαν 19 εμβρυομεταφορές. Καταγράφηκαν 4 θετικά τεστ κύησης και 1 αποβολή, χωρίς όμως επιτυχή γέννηση. Σχετικά με τον αριθμό των ώριμων ωαρίων (ΜΙΙ), η ομάδα Rescue IVM παρουσίασε μέση τιμή 4,55 με τυπική απόκλιση 3,15, ενώ η ομάδα ελέγχου είχε υψηλότερη μέση τιμή 5,90 με τυπική απόκλιση 3,52. Η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p=0,209). Αντίθετα,15το ποσοστό των ώριμων ωαρίων παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,024), με την ομάδα ελέγχου να επιτυγχάνει υψηλότερο ποσοστό (57,78%) σε σύγκριση με την ομάδα Rescue IVM (46,47%). Το ποσοστό γονιμοποίησης ανήλθε στο 55%, οδηγώντας στη δημιουργία 57 εμβρύων (31,7%), ωστόσο παρατηρήθηκε ότι ο αριθμός των γονιμοποιημένων ωαρίων ήταν μεγαλύτερος στην ομάδα ελέγχου (3,90 έναντι 3,00), χωρίς όμως η διαφορά να είναι στατιστικά σημαντική (p=0,203). Το ποσοστό των αναπτυσσόμενων εμβρύων ήταν 86,69% στην ομάδα ελέγχου και 77,74% στην ομάδα Rescue IVM, χωρίς και πάλι στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,371). Το ποσοστό βλαστοκύστεων παρουσίασε σχεδόν παρόμοιες τιμές μεταξύ των δύο ομάδων (52,36% για την ομάδα ελέγχου και 50,74% για την ομάδα Rescue IVM), χωρίς στατιστική διαφορά (p=0,857). Τέλος, ως προς τα έμβρυα καλής ποιότητας, η ομάδα Rescue IVM παρουσίασε ελαφρώς υψηλότερο μέσο όρο (1,85) συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου (1,70), χωρίς ωστόσο η διαφορά να είναι σημαντική (p=0,705). Η στατιστική ανάλυση με το Pearson Chi-Square test δείχνει ότι η διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων στα ποσοστά εγκυμοσυνών δεν είναι στατιστικά σημαντική (χ² = 1,758, df = 1, p = 0,185). Συμπερασματικά, η ομάδα Rescue IVM εμφάνισε τα υψηλότερα ποσοστά επιτυχίας τόσο σε επίπεδο γονιμοποίησης όσο και γεννήσεων, ενώ η ομάδα ελέγχου για το IVM παρουσίασε τα χαμηλότερα ποσοστά ωριμότητας και δημιουργίας εμβρύων. Αν και φαίνεται ότι στην ομάδα Rescue IVM υπάρχει μεγαλύτερο ποσοστό επιτυχίας σε σύγκριση με την ομάδα Ελέγχου, αυτή η διαφορά δεν είναι στατιστικά σημαντική. Η επίδραση της in vivo hCG στα περιστατικά Rescue IVM δείχνει να οδηγεί σε καλύτερα αποτελέσματα από εκείνα του κλασικού IVM με την επίδραση in vitro hCG, όμως η διαφορά δεν είναι στατιστικά σημαντική λόγω του σχετικά μικρού αριθμού περιστατικών που κατάφεραν να στρατολογηθούν έως τέλους στην έρευνα. Σαφώς και τα πρωτόκολλα μιας πλήρους ωοθηκικης διέγερσηςοδηγούν σε μεγαλύτερο αριθμό συλλεχθέντων ωαρίων, όσο και πιο αυξημένες πιθανότητες ωρίμανσης και κατά συνέπεια και μεγαλύτερου αριθμού ποιοτικών εμβρύων. Εν κατακλείδι, η τεχνική IVM δεν έχει αποδειχθεί ακόμα εξίσου αποτελεσματική σε σύγκριση με την κλασική εξωσωματική, σε παραμέτρους όπως τα ποσοστά κλινικών εγκυμοσυνών, καθώς και γεννήσεων υγιών τέκνων. Επίσης, ανησυχίες ως προς την ασφάλεια της μεθόδου έχουν εκφραστεί, σχετικά με τη μακροπρόθεσμη ασφάλεια της IVM, και απαιτούνται επιπλέον δεδομένα για να διεξαχθούν ασφαλή αποτελέσματα. Η IVM αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη τεχνική για συγκεκριμένες ομάδες ασθενών, αλλά η αποτελεσματικότητα και η ασφάλειά της παραμένουν υπό διερεύνηση, με την ύπαρξη 16 περαιτέρω επιστημονικών μελετών να είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την επιβεβαίωση των ευρημάτων αυτών. Λέξεις κλειδιά: in vitro ωρίμανση ωαρίων, εγκυμοσύνη, γέννηση, ωάριο, αποτελεσματικότητα, ασφάλεια, εργαστήριο, εξωσωματική γονιμοποίηση, επιπρόσθετες τεχνικές