Διερεύνηση του ρόλου των T-bet+ Β λεμφοκυττάρων στην παθογένεια του συστηματικού ερυθηματώδη λύκου

Abstract

Aim. T-bet+ B cells, known as age-associated B cells (ABCs) and/or double-negative B cells (DN), expand in various autoimmune diseases. This study aimed to clarify whether these populations of B cells serve as prognostic and/or therapeutic tools for human systemic lupus erythematosus (SLE). Methods. Peripheral blood from 22 active SLE patients and 10 healthy donors (HDs) was analyzed. Flow cytometry was used to enumerate T-bet+ B cells, as well as the subsets of ABCs (CD19+CD21–CD11c+T-bet+) and DN (CD19+IgD–CD27–CXCR5–T-bet+). All patients met the 2019 EULAR/ACR classification criteria for SLE. In addition to flow cytometry experiments, 24 hour-long whole blood assay cultures combined with in vitro pharmacological treatments of 1 hour were performed, so as to evaluate the effects of hydroxychloroquine, anifrolumab and fasudil (a Rho-associated protein kinase inhibitor) on the percentages of T-bet+ B cells. Moreover, data from previously published single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) studies, regarding 6 HDs and 11 active SLE patients, were used for a meta-analysis focusing on T-bet+ B cells, so as to allow characterization of the genes and pathways associated with the biology of ABCs/DN. Bioinformatics analysis was used to predict the effects of the aforementioned 3 pharmaceutical agents on the percentages of T-bet+ B cells. Results. T-bet+ B cells, as well as ABCs and DN, were expanded in SLE patients. Interestingly, percentages of T-bet+ B cells and DN B cells positively correlated with the SLEDAI score of the patients. Cell culture experiments conducted, confirmed that all 3 compounds examined can deplete T-bet+ B cells, while leaving unaffected the total numbers of lymphocytes, T cells and B cells, respectively. According to scRNA-seq analysis, T-bet was highly expressed in 2 specific B cell clusters with pathogenic characteristics for SLE (atypical memory B cells and activated naïve B cells). The analysis, furthermore, suggested that all three drugs of interest can target T-bet+ B cells. Conclusion. T-bet+ B cells expand in SLE patients and associate with disease activity, thus can probably serve as an additional disease activity and severity biomarker. Circumstantial data suggest that these cells may promote disease pathogenesis and may represent a therapeutic target.

Σκοπός. Τα Τ-bet+ Β λεμφοκύτταρα, γνωστά ως age-associated B cells (ABCs) ή/και double-negative B cells (DN), σημειώνουν ποσοστιαία αύξηση σε διάφορα αυτοάνοσα νοσήματα. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να διευκρινίσει εάν αυτοί οι πληθυσμοί από Β λεμφοκύτταρα δύνανται να αξιοποιηθούν ως προγνωστικοί και/ή θεραπευτικοί δείκτες για τον συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ) στον άνθρωπο. Μέθοδοι. Αναλύθηκε το περιφερικό αίμα από 22 ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ και 10 υγιείς δότες. Χρησιμοποιήθηκε κυτταρομετρία ροής για την απαρίθμηση των Τ-bet+ Β λεμφοκυττάρων, καθώς και των ABCs (CD19+CD21–CD11c+T-bet+) και DN (CD19+IgD–CD27–CXCR5–T-bet+) υποομάδων τους. Όλοι οι ασθενείς πληρούσαν τα κριτήρια ταξινόμησης EULAR/ACR 2019 για τον ΣΕΛ. Επιπρόσθετα των πειραμάτων κυτταρομετρίας, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες ολικού αίματος διάρκειας 24 ωρών, σε συνδυασμό με in vitro φαρμακολογικές παρεμβάσεις διάρκειας 1 ώρας, ώστε να αξιολογηθεί η επίδραση της υδροξυχλωροκίνης, της ανιφρολουμάμπης και του fasudil (αναστολέας της Rho-συσχετιζόμενης κινάσης) επί του ποσοστού των Τ-bet+ Β λεμφοκυττάρων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα από προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες, αναφορικά με την ανάλυση μεταγραφώματος σε επίπεδο μοναδιαίου κυττάρου (scRNA-seq) για 6 υγιείς δότες και 11 ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ, και πραγματοποιήθηκε μετα-ανάλυση των δεδομένων, εστιασμένη στα Τ-bet+ Β λεμφοκύτταρα, με σκοπό βέβαια το χαρακτηρισμό γονιδίων και μονοπατιών που σχετίζονται με τη βιολογία των ABCs/DN. H βιοπληροφορική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, αποσκοπούσε και στην πρόβλεψη των επιδράσεων των τριών προαναφερθέντων φαρμακευτικών ουσιών επί του ποσοστού των Τ-bet+ Β λεμφοκυττάρων. Αποτελέσματα. Τα Τ-bet+ Β λεμφοκύτταρα, καθώς επίσης και τα ABCs/DN, ανευρέθηκαν αυξημένα σε αριθμό, στους ασθενείς με ΣΕΛ. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα ποσοστά των Τ-bet+ Β λεμφοκυττάρων και των DN παρουσίασαν θετική και στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το SLEDAI σκορ των ασθενών. Οι πειραματικές διεργασίες που αφορούν σε κυτταροκαλλιέργειες, επιβεβαίωσαν ότι και οι τρεις υπό μελέτη φαρμακευτικές ουσίες δύνανται να μειώσουν τα ποσοστά από Τ-bet+ Β λεμφοκύτταρα, χωρίς να επηρεάζουν τους συνολικούς αριθμούς των λεμφοκυττάρων, των Τ λεμφοκυττάρων και Β λεμφοκυττάρων, αντίστοιχα. Σύμφωνα με την ανάλυση scRNA-seq, ο μεταγραφικός παράγοντας Τ-bet φαίνεται ότι εκφράζεται έντονα σε δύο συγκεκριμένες ομάδες Β λεμφοκυττάρων (atypical memory B cells και activated naïve B cells), που φέρουν παθογενετικά χαρακτηριστικά για τον ΣΕΛ. Η ανάλυση, επιπλέον, υπέδειξε ότι και τα τρία φάρμακα που εξετάστηκαν νωρίτερα in vitro, μπορούν να στοχεύσουν τα Τ-bet+ Β λεμφοκύτταρα. Συμπεράσματα. Τα Τ-bet+ Β λεμφοκύτταρα αυξάνονται σε ασθενείς με ΣΕΛ και σχετίζονται με την ενεργότητα της νόσου, επομένως θεωρείται ότι δύνανται να αποτελέσουν έναν επιπρόσθετο δείκτη ενεργότητας και βαρύτητας της ασθένειας. Τα αποτελέσματα της παρούσης, στο σύνολο τους, υποδεικνύουν ότι αυτά τα B λεμφοκύτταρα πιθανότατα προάγουν την παθογένεια της νόσου και μπορούν να αποτελέσουν έναν εν δυνάμει θεραπευτικό στόχο.