Evaluation of the osteogenic and osteoclastogenic potential of cell mono- and co-cultures in 3D printed composite scaffolds under dynamic conditions

Abstract

Bone tissue engineering (BTE) utilizes advanced technologies such as 3D printing, specifically fused deposition modeling (FDM), to create scaffolds that replicate native bone tissue. FDM enables the production of complex, patient-specific scaffolds with tailored porosity and mechanical properties. Incorporation of osteoinductive compounds like nano-hydroxyapatite (nHA) and Sr-substituted nHA (Sr-nHA) into these polymeric matrices enhances osteogenic differentiation and thus bone regeneration. In vitro evaluation methods often use mono-culture models with osteoblasts or osteoclasts, but these do not fully recapitulate the interactions of native bone tissue. Co-culture models of osteoblasts and osteoclasts better mimic the natural bone remodeling. Mechanical stimulation within these models is crucial, as it recreates the bone mechanical environment, promoting essential cellular activities. Immunomodulation is also vital, as the immune response affects bone healing. The aim of this thesis was to develop a growth factor free co-culture system using human bone marrow mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) and human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs) and dynamic culture conditions to evaluate the osteogenic and osteoclastogenic potential within 3D composite scaffolds composed of PLLA/PCL/PHBV and the osteoinductive inorganic compounds nHA and Sr-nHA, mimicking the physiological 3D environment of native human bone tissue. Additionally, the immunomodulatory properties of the composite scaffolds were investigated under dynamic culture conditions with macrophages to predict the implant's influence on pro- or anti-inflammatory phenotypes. The nHA and Sr-nHA were evaluated for their osteogenic properties in powder form and depicted excellent osteogenesis related cellular responses. The inorganic powders were incorporated into the polymeric PLLA/PCL/PHBV matrix and evaluated for their osteogenic and osteoclastogenic responses, and the Sr-nHA substituted scaffolds depicted increased osteogenic and suppressedosteoclastogenic responses in a supplement free co-culture system. Moreover, the application of cyclic uniaxial compression on pre-osteoblasts seeded polymeric scaffolds enhanced the osteogenic properties of the material. Capitalizing on these findings, the polymeric scaffolds supplemented with Sr-nHA were used in the established co-culture under the application of mechanical stimulation, leading to increased osteogenesis and suppressed osteoclastogenesis. Moreover, the macrophage polarization examined in dynamic culture indicated stronger commitment towards the anti-inflammatory phenotype after mechanical stimulation.

Η μηχανική οστίτη ιστού χρησιμοποιεί προηγμένες τεχνολογίες όπως η τρισδιάστατη εκτύπωση, για τη δημιουργία ικριωμάτων που μπορούν να αναπαράξουν τη λειτουργία του φυσιολογικού οστού, επιτρέποντας την παραγωγή πολύπλοκων, ειδικών για τον ασθενή ικριωμάτων με προσαρμοσμένο πορώδες και μηχανικές ιδιότητες. Η ενσωμάτωση οστεοεπαγωγικών ενώσεων όπως ο νανο-υδροξυαπατίτης (nHA) και ο στρόντιο-υποκατεστημένος νανο-υδροξυαπατίτης (Sr-nHA) σε αυτές τις πολυμερικές μήτρες ενισχύει την οστεογενή διαφοροποίηση και συνεπώς την οστική αναγέννηση. Οι μέθοδοι in vitro αξιολόγησης συχνά χρησιμοποιούν μοντέλα μονοκαλλιέργειας οστεοβλαστών ή οστεοκλαστών, των κύριων κυτταρικών τύπων που ελέγχουν την αναγέννεση των οστών, χωρίς ωστόσο να λαμβάνουν υπόψιν τους τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτών των δύο στο φυσιολογικό οστίτη ιστό. Τα μοντέλα συν-καλλιέργειας οστεοβλαστών και οστεοκλαστών, από την άλλη μιμούνται καλύτερα το φυσικό τρόπο αναδόμησης των οστών. Επιπλέον, η εφαρμογή μηχανικής διέγερσης σε αυτά τα μοντέλα είναι ζωτικής σημασίας, καθώς αναδημιουργεί το μηχανικό περιβάλλον του οστού, προάγοντας βασικές κυτταρικές δραστηριότητες. Πολύ σημαντική είναι επίσης και ημελέτη της συμπεριφοράς των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, καθώς η ανοσολογική απόκριση κατά την εισαγωγή ενός εμφυτεύματος στον οργανισμό επηρεάζει την επούλωση των οστών. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός συστήματος συν-καλλιέργειας χωρίς αυξητικούς παράγοντες με χρήση ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων του μυελού των οστών (hBM-MSCs) και μονοπύρηνων κυττάρων ανθρώπινου περιφερικού αίματος (hPBMCs) υπό δυναμικές συνθήκες καλλιέργειας για την αξιολόγηση της οστεογενούς και οστεοκλαστογενούς δυναμικής μέσα σε τρισδιάστατα ικριώματα που αποτελούνται από PLLA/PCL/PHBV και τις οστεοεπαγωγικές ανόργανες ενώσεις nHA και Sr-nHA, οι οποίες μιμούνται το φυσιολογικό 3D περιβάλλον του εγγενούς ανθρώπινου οστίτη ιστού. Επιπλέον, οι ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες αυτών των ικριωμάτων ερευνήθηκαν υπό δυναμικές συνθήκες σε καλλιέργεια με μακροφάγα κύτταρα για την πρόβλεψη της επίδρασης του εμφυτεύματος σε προ- ή αντι-φλεγμονώδεις φαινότυπους. Τα nHA και Sr-nHA αξιολογήθηκαν για τις οστεογενείς τους ιδιότητες σε μορφή σκόνης δίνοντας εξαιρετικές κυτταρικές αποκρίσεις που σχετίζονται με την οστεογέννεση. Οι ανόργανες σκόνες ενσωματώθηκαν στην πολυμερική μήτρα PLLA/PCL/PHBV και αξιολογήθηκαν ως προς την οστεογενή και οστεοκλαστογενή τους απόκριση, με τα υποκατεστημένα ικριώματα με Sr-nHA να εμφανίζουν αυξημένη οστεογενή και μειωμένη οστεοκλαστογενή απόκριση σε σύστημα συν-καλλιέργειας χωρίς συμπληρώματα. Επιπλέον, η εφαρμογή μηχανικής διέγερσης στα πολυμερικά ικριώματα με προ-οστεοβλαστικά κύτταρα ενίσχυσε τις οστεογενείς ιδιότητες του υλικού. Αξιοποιώντας αυτά τα ευρήματα, τα πολυμερή ικριώματα υποκατεστημένα με Sr-nHA χρησιμοποιήθηκαν στην συν-καλλιέργεια υπό την εφαρμογή μηχανικής διέγερσης, που οδήγησε σε αυξημένη οστεογένεση και μειωμένη οστεοκλαστογένεση. Επιπλέον, η πόλωση των μακροφάγων που εξετάστηκε σε δυναμική καλλιέργεια έδειξε ενισχυμένο αντιφλεγμονώδη φαινότυπο μετά από μηχανική διέγερση.