Μελέτη μεθυλίωσης γονιδίων-δεικτών καρκίνου ουροδόχου κύστης σε ούρα και ουροδόχο κύστη ασθενών με νευρογενή δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού

Abstract

DNA methylation is an epigenetic process occurs in genes’ promoters and results in the transcriptional silencing of genes. DNA methylation is a frequent event in bladder cancer, participating in tumor initiation and progression. Bladder cancer is a major health issue in patients suffering from neurogenic lower urinary tract dysfunction (NLUTD), although the pathogenetic mechanisms of the disease remain unclear. In this population, bladder cancer is characterized by aggressive histopathology, advanced stage during diagnosis, and high mortality rates. Currently, there is a scarcity of specific guidelines for bladder cancer screening and the development of urine biomarkers for bladder cancer seems to be an attractive non-invasive method of screening or risk stratification in this patient population. The objective of this study was the investigation of DNA hypermethylation in five gene promoters (RASSF1, APC, DAPK, RARβ, TERT), previously associated with bladder cancer, in the urine of NLUTD patients, and in comparison with healthy individuals, and in bladder tissue of NLUTD patients. This was a prospective case–control study that recruited neurourology outpatients who had suffered from NLUTD for at least 5 years. They all underwent cystoscopy and biopsy for bladder cancer screening following written informed consent. DNA was extracted from urine samples of patients and controls and from the available bladder tissue samples of patients. The DNA methylation status of the RASSF1, RARβ, DAPK, TERT and APC gene promoters was assessed via quantitative methylation-specific PCR. In this study, 41 patients of mixed NLUTD etiology and 35 controls were enrolled. DNA was detected in 36 patients’ urine specimens and in those of 22 controls. In the urine samples, DNA was hypermethylated in at least one of five gene promoters in 17/36 patients and in 3/22 controls (47.22% vs. 13.64%, respectively, p = 0.009). RASSF1 was hypermethylated in 10/17 (58.82%) urine samples with DNA detection, APC in 7/17 (41.18%), DAPK in 4/17 (23.53%), RARβ in 3/17 (17.56%) and TERT in none urine sample. According to a multivariate logistic regression analysis, NLUTD and male gender were significantly associated with hypermethylation (OR = 7.43, p = 0.007 and OR = 4.21; p = 0.04, respectively). In the tissue samples, DNA hypermethylation was detected in at least one gene promoter of the panel in all tissue samples. RARβ was hypermethylated in 22/24 (91.67%) tissue samples, RASSF1 and DAPK were hypermethylated in 20/24 (83.33%), APC in 9/24 (37.5%), and TERT in none of the tissue samples. Histology revealed TaLG BCa in two (4,88%) patients and urothelial squamous metaplasia in five (12,2%) patients. Chronic bladder inflammation was present in bladder biopsies of 35 (85,37%) patients. In conclusion, DNA hypermethylation in a panel of five genes promoters, previously associated with bladder cancer, in the urine was significantly more frequent in NLUTD patients than in the controls. We also observed high rates of DNA hypermethylation in bladder tissue, suggesting an epigenetic field effect and possible risk of bladder cancer development. Further research is needed to assess the clinical implications and possible associations between DNA hypermethylation, recurrent urinary tract infections, chronic inflammation and bladder cancer etiopathogenesis in NLUTD patients.

Η μεθυλίωση του DNA είναι μια επιγενετική διαδικασία που εμφανίζεται στους εκκινητές των γονιδίων με αποτέλεσμα τη μεταγραφική τους σίγαση. Η μεθυλίωση του DNA είναι συχνή στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και συμμετέχει στην έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι σημαντικό πρόβλημα υγείας σε ασθενείς που πάσχουν από νευρογενή δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού συστήματος, με ασαφείς παθογενετικούς μηχανισμούς. Σε αυτόν τον πληθυσμό, ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης χαρακτηρίζεται από επιθετική ιστοπαθολογία, προχωρημένο στάδιο κατά τη διάγνωση και υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Επί του παρόντος, υπάρχει έλλειψη διεθνών κατευθυντήριων γραμμών για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και η ανάπτυξη βιοδεικτών των ούρων φαίνεται ως μια ελκυστική μη επεμβατική μέθοδος προσυμπτωματικού ελέγχου ή διαστρωμάτωσης κινδύνου για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης σε ασθενείς με νευρογενή δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού. Ο σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της υπερμεθυλίωσης του DNA πέντε εκκινητών γονιδίων (RASSF1, APC, DAPK, RARβ, TERT), συσχετιζόμενα με τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, στα ούρα ασθενών με νευρογενή δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού και σε σύγκριση με υγιή άτομα, καθώς στον ιστό της ουροδόχου κύστης των ασθενών. Είναι μια προοπτική μελέτη ασθενών – μαρτύρων που στρατολόγησε νευροουρολογικούς ασθενείς με νευρογενή δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού για τουλάχιστον 5 έτη. Όλοι υποβλήθηκαν σε κυστεοσκόπηση και βιοψία ουροδόχου κύστης για τον προσυμπτωματικό έλεγχο καρκίνου της ουροδόχου κύστης μετά από γραπτή έντυπη συγκατάθεση. Το DNA εξήχθη από δείγματα ούρων των ασθενών και των υγιών μαρτύρων και από τα διαθέσιμα δείγματα ιστού της ουροδόχου κύστης των ασθενών. Η κατάσταση μεθυλίωσης DNA των εκκινητών των γονιδίων RASSF1, RARβ, DAPK, TERT και APC αξιολογήθηκε μέσω της ποσοτικής ειδικής για την μεθυλίωση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Στη μελέτη στρατολογήθηκαν 41 ασθενείς με μικτής αιτιολογίας νευρογενή δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού και 35 μάρτυρες. DNA ανιχνεύθηκε στα δείγματα ούρων από 36 ασθενείς και από 22 υγιείς μάρτυρες. Στα δείγματα ούρων, το DNA βρέθηκε υπερμεθυλιωμένο σε τουλάχιστον έναν από τους πέντε εκκινητές γονιδίων σε 17/36 ασθενείς και σε 3/22 μάρτυρες (47,22% έναντι 13,64%, αντίστοιχα, p = 0,007). Ο εκκινητής του RASSF1 βρέθηκε υπερμεθυλιωμένος σε 10/17 (58,82%) δείγματα ούρων με ανιχνευση DNA, του APC σε 7/17 (41,18%), του DAPK σε 4/17 (23,53%), του RARβ σε 3/17 (17,56%) και του TERT σε κανένα δείγμα ούρων. Σύμφωνα με την πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης, η νευρογενής δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού και το άρρεν φύλο συσχετίστηκαν σημαντικά με την υπερμεθυλίωση (OR = 7,43, p = 0,007 και OR = 4,21, p = 0,04, αντίστοιχα). Στα δείγματα ιστού, ανιχνεύθηκε υπερμεθυλίωση DNA σε τουλάχιστον έναν εκκινητή γονιδίου της μελέτης σε όλα τα δείγματα ιστού. Ο εκκινητής του RARβ βρέθηκε υπερμεθυλιωμένος σε 22/24 (91,67%) δείγματα ιστού, των RASSF1 και DAPK σε 20/24 (83,33%), του APC σε 9/24 (37,5%), και του TERT σε κανένα από τα δείγματα ιστού. Η ιστολογική εξέταση αποκάλυψε TaLG BCa σε δύο (4,88%) ασθενείς και πλακώδη μεταπλασία του ουροθηλίου σε πέντε (12,2%) ασθενείς. Χρόνια φλεγμονή του ουροθηλίου αναγνωρίστηκε ιστολογικά στις βιοψίες ουροδόχου κύστης 35 (85,37%) ασθενών. Συμπερασματικά, η υπερμεθυλίωση του DNA σε έναν συνδυασμό πέντε εκκινητών γονιδίων, που προηγουμένως είχαν συσχετιστεί με τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, στα ούρα ήταν σημαντικά πιο συχνή στην ομάδα των ασθενών με νευρογενή δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού από ότι στην ομάδα ελέγχου. Παρατηρήσαμε επίσης υψηλά ποσοστά υπερμεθυλίωσης του DNA στον ιστό της ουροδόχου κύστης, υποδηλώνοντας ένα επιγενετικό έλλειμα πεδίου και πιθανό κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για την αξιολόγηση των κλινικών επιπτώσεων και των πιθανών συσχετίσεων μεταξύ της υπερμεθυλίωσης του DNA, των υποτροπιαζουσών ουρολοιμώξεων, της χρόνιας φλεγμονής και της αιτιοπαθογένειας του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε ασθενείς που πάσχουν από νευρογενή δυσλειτουργία του κατώτερου ουροποιητικού.