Διερεύνηση της επίδρασης βιοδραστικών ενώσεων από στελέχη κυανοβακτηρίων σε φυτικά κύτταρα

Abstract

Cyanobacteria are prokaryotic photosynthetic organisms, many of which produce bioactive compounds harmful for the survival and growth of other organisms, including plants. Their presence in water bodies of Greece used for irrigation may be detrimental to agricultural production and consumers’ health, as the bioactive compounds released into water may be absorbed by cultivated plants and bioaccumulate. This PhD thesis aims to study the effects of cyanobacterial bioactive compounds on plant cell structure and function, as well as possible pathways of plant cell response to the toxicity of these compounds. Cyanobacterial strains, isolated from various habitats in Greece, were used as source of bioactive compounds. Commercially available toxins or other cyanobacterial compounds in pure form were also used. Experiments were carried out either on rice (Oryza sativa), an organism of great economic importance, or on the model plant Arabidopsis thaliana. Light, confocal and transmission electron microscopy were applied for documenting the effects, while stress response pathways were investigated through biochemical and molecular methods. Extracts produced from the strains were used for treatments of varying duration on Oryza sativa roots. Some extracts contained microcystins (MCs), the most studied cyanobacterial toxins (known as cyanotoxins), while others did not contain any known cyanotoxins. Pure microcystin-LR (MC-LR) was also used for treatments. Initially, plant cytoskeleton (microtubules and F-actin) organization was examined in roots treated with a MC-rich extract or with pure MC-LR. Fine cell structure alterations and cell cycle progression defects were recorded. F-actin was negatively affected in a time-dependent manner by both MC-LR and the extract, resulting in alterations of endomembrane network distribution. Cytoskeletal alterations were also observed after exposure to extracts not containing MCs or other known cyanotoxins, a finding suggesting that other bioactive compounds, apart from MCs, are also capable of negatively affecting the plant cytoskeleton. In addition, the induction of oxidative stress, cell cycle perturbations and cell death phenomena were studied. Since microtubules regulate the architecture of the plant cell wall, its composition was studied in differentiated Oryza sativa root cells, treated with selected cyanobacterial extracts or pure MC-LR. In affected cells, the distribution of pectins appeared to be restricted, while pectin modifying enzymes were inhibited. On the contrary, the distribution of glucans and intracellular calcium levels increased. The extensive occurence of glucans may represent a compensatory mechanism, in order to maintain the mechanical stability of cell walls and provide a barrier against cyanobacterial toxicity. Furthermore, growth and gravitropic response experiments were conducted on Arabidopsis thaliana roots under treatment with sulcatol, a volatile organic compound produced by cyanobacteria. The observed agravitropic root phenotype, induced by sulcatol, could be associated with defective auxin signaling, probably related to inhibition of specific transcription factors in the auxin signaling pathway. In conclusion, the present study highlights F-actin and the cell wall as novel targets of the toxicity of MCs and other cyanobacterial compounds in plant cells. Furthermore, the negative effects of poorly studied substances, such as sulcatol, on plants and their association with disruption of phytohormones (in this case auxin) are revealed.

Τα κυανοβακτήρια είναι προκαρυωτικοί φωτοσυνθετικοί οργανισμοί, πολλοί εκ των οποίων παράγουν βιοδραστικές ενώσεις επιβλαβείς για την επιβίωση και ανάπτυξη άλλων οργανισμών, μεταξύ των οποίων και φυτά. Η παρουσία τους σε υδατοσυλλογές της Ελλάδας που χρησιμοποιούνται για άρδευση καλλιεργούμενων εδαφών, μπορεί να αποβεί επιζήμια για την αγροτική παραγωγή και την υγεία των καταναλωτών, καθώς οι βιοδραστικές ενώσεις που απελευθερώνονται στο νερό μπορεί να απορροφώνται από τα καλλιεργούμενα φυτά και να βιοσυσσωρεύονται. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της επίδρασης βιοδραστικών ενώσεων των κυανοβακτηρίων στη δομή και λειτουργία των φυτικών κυττάρων, και των πιθανών μονοπατιών απόκρισης των φυτικών κυττάρων στην τοξικότητα των ενώσεων αυτών. Πηγή βιοδραστικών ενώσεων υπήρξαν στελέχη κυανοβακτηρίων που απομονώθηκαν από ποικίλα ενδιαιτήματα της Ελλάδας. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν εμπορικά διαθέσιμες τοξίνες ή άλλες ενώσεις των κυανοβακτηρίων σε καθαρή μορφή. Οι επιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στο ρύζι (Oryza sativa), οργανισμό μεγάλης οικονομικής σημασίας, και στο φυτό-πρότυπο Arabidopsis thaliana. Η παρατήρηση των επιπτώσεων στα κύτταρα πραγματοποιήθηκε με οπτική, συνεστιακή και ηλεκτρονική μικροσκοπία, ενώ τα μονοπάτια απόκρισης στις καταπονήσεις προσεγγίστηκαν με συνδυασμό βιοχημικών και μοριακών μεθόδων. Εκχυλίσματα, που παρήχθησαν από τα στελέχη κυανοβακτηρίων, χρησιμοποιήθηκαν για επιδράσεις ποικίλης χρονικής διάρκειας στη ρίζα του Oryza sativa. Ορισμένα εκχυλίσματα περιείχαν μικροκυστίνες (MCs), τις πλέον μελετημένες κυανοβακτηριακές τοξίνες (γνωστές ως κυανοτοξίνες), ενώ άλλα δεν περιείχαν κάποια γνωστή κυανοτοξίνη. Επιδράσεις πραγματοποιήθηκαν και με καθαρή μικροκυστίνη-LR (MC-LR). Αρχικά, εξετάστηκε η οργάνωση του φυτικού κυτταροσκελετού (μικροσωληνίσκοι και F-ακτίνη) σε επηρεασμένα κύτταρα ρίζας Oryza sativa, καθώς και αλλοιώσεις της λεπτής δομής των κυττάρων, έπειτα από επιδράσεις με εκχύλισμα που περιείχε MCs ή με καθαρή MC-LR. Η F-ακτίνη επηρεάστηκε αρνητικά κατά τρόπο χρονοεξαρτώμενο, τόσο από την MC-LR όσο και από το εκχύλισμα, προκαλώντας αλλοιώσεις του ενδομεμβρανικού δικτύου. Κυτταροσκελετικές αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν και έπειτα από επιδράσεις με εκχυλίσματα που δεν περιείχαν MCs ή άλλες γνωστές κυανοτοξίνες, εύρημα που υποδεικνύει την ύπαρξη άλλων βιοδραστικών ενώσεων που επιδρούν αρνητικά στον φυτικό κυτταροσκελετό. Μελετήθηκε, επίσης, η επαγωγή οξειδωτικής καταπόνησης, διαταραχών του κυτταρικού κύκλου και φαινομένων κυτταρικού θανάτου στη ρίζα. Δεδομένου ότι οι μικροσωληνίσκοι ρυθμίζουν την αρχιτεκτονική του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος, ελέγχθηκε η σύστασή του σε διαφοροποιημένα κύτταρα ρίζας του ίδιου φυτού που δέχτηκαν επίδραση με επιλεγμένα εκχυλίσματα κυανοβακτηρίων ή καθαρή MC-LR. Στα επηρεασμένα κύτταρα παρατηρήθηκε περιορισμένη κατανομή πηκτινών και αναστολή των σχετικών τροποποιητικών τους ενζύμων, με παράλληλη αύξηση στην κατανομή των γλυκανών και του ενδοκυτταρικού ασβεστίου. Η αυξημένη παρουσία γλυκανών πιθανά αποτελεί αντισταθμιστικό μηχανισμό, προκειμένου να διατηρηθεί η μηχανική σταθερότητα των τοιχωμάτων και να περιοριστεί η κυανοβακτηριακή τοξικότητα. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα αύξησης και βαρυτροπικής απόκρισης στη ρίζα του Arabidopsis thaliana υπό την επίδραση σουλκατόλης, πτητικής οργανικής ένωσης των κυανοβακτηρίων. Ο αβαρυτροπικός φαινότυπος της ρίζας που προκλήθηκε από τη σουλκατόλη συνδέθηκε με διαταραχές της φυτορμόνης αυξίνη, φαινόμενο που ενδεχομένως σχετίζεται με δυσλειτουργία μεταγραφικών παραγόντων στο μονοπάτι σηματοδότησής της. Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή αναδεικνύονται η F-ακτίνη και το κυτταρικό τοίχωμα ως νέοι στόχοι της τοξικότητας των μικροκυστινών, αλλά και άλλων κυανοβακτηριακών ενώσεων, στο φυτικό κύτταρο. Επίσης, αναδεικνύονται οι αρνητικές επιπτώσεις ελάχιστα μελετημένων ουσιών, όπως η σουλκατόλη, για τα φυτά και η σύνδεσή αυτών με διαταραχές φυτορμονών, εν προκειμένω της αυξίνης.