Παραγωγή νανοσωλήνων και σύνθετων πολυμερών με εφαρμογή στα τρόφιμα

Abstract

Over the past few decades, nanotechnology, nano-synthetic materials and their applications have gained attention. Carbon NanoTubes (CNTs) are among the most used nanomaterials. Information on CNTs was first published in 1991 and since then this nanomaterial has established rapidly in growing applications such us sensors, nano-medicine, environment, energy and others. However, their use in biological and biomedical sector for human system is restricted due to their increased toxicity to human body. The size of nanotubes can affect the toxicity of CNTs, particularly those with size under 100 nm. They can affect lungs and whole respiratory system by activating immunological responses. Also, the prolonged and excessive exposure to CNTs can cause inflammation and oxidative stress. In order to avoid the side effects of the use of CNTs we anticipated that alternative agricultural materials, can be used for the production of nanotubes. Inexpensive and renewable natural resources was explored for the production of carbohydrate nano-tubes (CHNTs). Such materials can be prepared using residual plants-stalks, generated as byproducts from each crop. Huge annual amounts of agricultural wastes, including wheat straw, sunflower-stems and corncob are produced globally after harvesting of wheat grains, corn, and sunflower seeds. Nanofibers produced from natural cellulosic waste materials and their application in nanocomposite materials is a topic of interest. The benefits of cellulose nanofibers are due to the fact that they are biodegradable, biocompatible, and renewable. Previous studies have shown that lignocellulosic materials after delignification, can be used for formation of tubular cellulose, with micro and nano dimensions. CHNTs can be easily metabolized in human body without any toxicity, hence can be used in the designing of an efficient drug delivery system. Therefore, the first aim of this work was the production of carbohydrate-nanotubes (CHNTs), a new generation of nano-tubes, from cellulose content of agricultural residues via preparation of tubular cellulose (TC), and application of TC in an enzymatic process. For this purpose, the lignocellulosic agroindustrial wastes that used were wheat straw, sunflower stem, corn cob and fir sawdust. Tubular cellulose (TC) was produced after delignification of the raw materials and then enzymatic hydrolysis with cellulases enzymes was applied to TC, hence CHNTs were produced. Among the four materials used, corncob has proved the most productive. TC tubes from corncob were cut-short with cellulase, produced from Trichoderma reesei, to carbohydrate-tubes of nano-size. FTIR and XRD analysis revealed stability of CHNTs chemical structure. CHNTs were isolated from the solution of cellulose-hydrolysis after freeze-drying. The nano-dimension tubes of the final product proved by measurements of length by TEM and the diameter even of 40-50 Å with porosimetry-analysis. Then, composite materials of TC with starch gel (SG) were also prepared and enzymatic hydrolysis with amylase/cellulase enzymes followed in order to examine any improvement of the properties of the produced CHNTs by this way. In this study, the material that proved to be the most productive was wheat straw as, from the first 5 hours of hydrolysis, it gave CHNTs with very good properties. In general, all materials showed much better properties during the enzymatic hydrolysis of TC/SG compared to the hydrolysis of TC and in fact in a much shorter time. Thus, starch gel leads to better results and improvement of the characteristics of the produced CHNTs.Thereinafter, the quality and safety of foods such as meat, meat products and juices, are assured mainly through heat treatments and chemical preservatives. However, there is a growing trend in the food industry for lowering energy and water demands, and the chemicals and additives that may have negative effects on human health. More specific, nitrite salts play a decisive role in cured meat products by providing stability of red color and specific flavor, by preventing lipid oxidation and by providing safety of product for consumption, as nitrites are recognized for their bacteriostatic and bacteriocidal effects against pathogenic bacteria, such as Salmonella enterica serovar Typhimurium, Listeria spp., and Clostridium botulinum, the main and most dangerous microorganisms that can grow in meat and meat products. However, the legislation has been imposed limits to the amount of nitrite that can be added in order to prevent side effects through the addition of excessive quantities of nitrite salts to food. This can be attributed to the formation of noxious nitrosamines that can cause cancer. In addition, although sodium benzoate (SB) has effective antimicrobial activity and it is used widely in juices and drinks, it also has some side effects on the human body, such as burdening the liver, activating immunological responses, while mutagenic and cytotoxic effects have been proven in vitro on human lymphocytes, thus causing cancer. So, the limitation of chemical preservatives is seemed to be an emergency.Following that trend, in this part of the study, we aimed at the reduction of chemical preservatives in foods. This was achieved by encapsulating potassium nitrite (KNO2) and sodium benzoate (SB) in edible tubular cellulose (ETC), derived from natural sources, and in ETC using starch gel (SG) as intermediate carrier (ETC/SG). The encapsulated KNO2 was applied in pork and veal meat and pork sausages, and the encapsulated SB was applied in orange juice. The results showed that the encapsulation and gradual release of KNO2 using ETC in meat and meat products was achieved to a great extent, and mainly the release of KNO2 encapsulated in ETC/SG, especially at low storage temperatures, can be controlled and a large part of the preservative can remain encapsulated in ETC/SG for a long time. Also, through the study of the microbiological load, the effectiveness of this preservation method was determined. The meat and sausage samples treated with KNO2 encapsulated in ETC/SG, showed an important inhibition in the growth of microorganisms even after 10 days of storage. Therefore, this method led to a successful preservation of the products. This technology was technoeconomically evaluated and proved, according to estimations of our research team, to be cost effective giving the possibility for potential scale-up of bioreactor to establish the process of preservatives production with this method on industrial level.In the case of SB, the presence of SG strongly affected the release of the preservative too, thus suggesting the possibility of encapsulation using SG to control the release mechanism of encapsulated substances. This can be attributed to the better encapsulation of KNO2 and SB in the starch gel matrix which allows low mobility of the preservatives molecules. However, both ETC and ETC/SG materials could be of practical use depending on the required preservatives delivery rate. SB gradual release in orange juice was achieved, as most of SB remained encapsulated in ETC and ETC/SG achieving limited release. The treatment with SB encapsulated in TC/SG proved capable of reducing the microbiological load of the juices, indicating an effective preservation method. Τhe results of this thesis are promising and useful for potential applications, offering the possibility for additional research in many fields. Τhey can also have a big impact on the global economy, as they concern low-cost technologies that are human and environment friendly and are applied in fields where the market size is quite high and of great importance.

Τις τελευταίες δεκαετίες, η νανοτεχνολογία, τα νανοσύνθετα υλικά και οι εφαρμογές τους έχουν κερδίσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Οι νανοσωλήνες άνθρακα (CNTs) είναι από τα πιο χρησιμοποιούμενα νανοϋλικά. Πληροφορίες για τους CNTs δημοσιεύτηκαν για πρώτη φορά το 1991 και από τότε αυτό το νανοϋλικό έχει ταχέως καθιερωθεί σε αναπτυσσόμενες εφαρμογές όπως οι αισθητήρες, η νανοϊατρική, το περιβάλλον, η ενέργεια, κ.ά. Ωστόσο, η χρήση τους στον τομέα της βιοϊατρικής που ασχολείται με τον ανθρώπινο οργανισμό είναι περιορισμένη λόγω της αυξημένης τοξικότητάς τους. Το μέγεθος των νανοσωλήνων μπορεί να επηρεάσει την τοξικότητα των CNTs, ιδιαίτερα εκείνων με μέγεθος κάτω από 100 nm. Μπορούν να επηρεάσουν τους πνεύμονες και ολόκληρο το αναπνευστικό σύστημα ενεργοποιώντας ανοσολογικές αποκρίσεις. Επίσης, η παρατεταμένη και υπερβολική έκθεση σε CNTs μπορεί να προκαλέσει φλεγμονή και οξειδωτικό στρες.Προκειμένου να αποφευχθούν οι παρενέργειες από τη χρήση των CNTs, θεωρήσαμε ότι εναλλακτικά γεωργικά υλικά, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή νανοσωλήνων. Διερευνήθηκαν φθηνοί και ανανεώσιμοι φυσικοί πόροι για την παραγωγή υδατανθρακούχων νανοσωλήνων (CHNTs). Τέτοια υλικά μπορούν να παρασκευαστούν χρησιμοποιώντας υπολείμματα των φυτών όπως ο μίσχος τους, που παράγονται ως υποπροϊόντα από διάφορες καλλιέργειες. Τεράστιες ποσότητες γεωργικών αποβλήτων, συμπεριλαμβανομένων των άχυρων σίτου, του κορμού ηλίανθου και του στελέχους καλαμποκιού (κότσαλα) παράγονται κάθε χρόνο παγκοσμίως μετά τη συγκομιδή των κόκκων σιταριού, του καλαμποκιού και των ηλιόσπορων. Οι νανοΐνες που παράγονται από φυσικά κυτταρινούχα απόβλητα και η εφαρμογή τους σε νανοσύνθετα υλικά έχουν κερδίσει αρκετό ενδιαφέρον. Τα οφέλη των νανοϊνών κυτταρίνης οφείλονται στο γεγονός ότι είναι βιοαποικοδομήσιμες, βιοσυμβατές και ανανεώσιμες. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι λιγνινοκυτταρινούχα υλικά μετά από απολιγνινοποίηση, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για παραγωγή σωληνωτής κυτταρίνης, με μίκρο- και νάνο- διαστάσεις. Οι CHNTs θα μπορούν εύκολα να μεταβολιστούν στο ανθρώπινο σώμα χωρίς καμία τοξικότητα, επομένως μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο σχεδιασμό ενός αποτελεσματικού συστήματος χορήγησης φαρμάκων. Ως εκ τούτου, ο πρώτος στόχος αυτής της εργασίας ήταν η παραγωγή υδατανθρακούχων νανοσωλήνων (CHNTs), μιας νέας γενιάς νανοσωλήνων, από κυτταρινούχα γεωργικά απόβλητα μέσω παρασκευής σωληνωτής κυτταρίνης (TC), και κατόπιν υποβολή της TC σε μια ενζυμική διαδικασία. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τα λιγνινοκυτταρινούχα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα άχυρο σίτου, στέλεχος ηλίανθου, στέλεχος καλαμποκιού, και πριονίδι ελάτου. Η σωληνωτή κυτταρίνη (TC) παρήχθη μετά από απολιγνινοποίηση των πρώτων υλών και στη συνέχεια εφαρμόστηκε ενζυμική υδρόλυση με ένζυμα κυτταρινάσες προς παραγωγή των CHNTs. Μεταξύ των τεσσάρων υλικών που χρησιμοποιήθηκαν, το στέλεχος καλαμποκιού αποδείχθηκε ως το πιο αποτελεσματικό στη διαδικασία αυτή. Οι σωλήνες TC από στέλεχος καλαμποκιού κόπηκαν με τα ένζυμα κυτταρινασών, που παρήχθησαναπό τον μικροοργανισμό Trichoderma reesei, σε υδατανθρακούχους σωλήνες νάνο- μεγέθους. Οι αναλύσεις φασματοσκοπίας FTIR και η περίθλαση ακτίνων Χ (XRD) έδειξαν σταθερότητα της χημικής δομής των CHNTs. CHNTs απομονώθηκαν από το διάλυμα υδρόλυσης της TC από στέλεχος καλαμποκιού μετά από ξήρανση με λυοφιλίωση. Οι νάνο- διαστάσεις των σωλήνων του τελικού προϊόντος αποδείχθηκαν με μετρήσεις μέσω μικροσκοπίας TEM, ενώ διάμετρος νανοσωλήνων ακόμη και 40-50 Å μετρήθηκε με ανάλυση ποροσιμετρίας. Στη συνέχεια, παρασκευάστηκαν επίσης σύνθετα υλικά TC με πηκτή αμύλου (SG) και ακολούθησε ενζυμική υδρόλυση με ένζυμα αμυλάσες/κυτταρινάσες προκειμένου να εξεταστεί τυχόν βελτίωση των ιδιοτήτων των παραγόμενων CHNTs με αυτόν τον τρόπο παραγωγής. Σε αυτή τη μελέτη, το υλικό που αποδείχθηκε το πιο παραγωγικό ήταν το άχυρο σίτου καθώς από τις πρώτες 5 ώρες υδρόλυσης έδωσε CHNTs με πολύ καλές ιδιότητες. Γενικά, όλα τα υλικά παρουσίασαν πολύ καλύτερες ιδιότητες κατά την ενζυμική υδρόλυση των TC/SG σε σύγκριση με την υδρόλυση της TC και μάλιστα σε πολύ μικρότερο χρόνο. Έτσι, η πηκτή αμύλου οδήγησεσε καλύτερα αποτελέσματα και βελτίωση των χαρακτηριστικών των παραγόμενων CHNTs.Εν συνεχεία, η ποιότητα και η ασφάλεια των τροφίμων όπως το κρέας, τα προϊόντα κρέατος και οι χυμοί, διασφαλίζονται κυρίως μέσω θερμικών επεξεργασιών και χημικών συντηρητικών. Ωστόσο, υπάρχει μια αυξανόμενη τάση στη βιομηχανία τροφίμων για μείωση των απαιτήσεων ενέργειας και νερού, καθώς και των χημικών πρόσθετων που μπορεί να έχουν αρνητικές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία. Πιο συγκεκριμένα, τα νιτρώδη άλατα παίζουν καθοριστικό ρόλο στα αλλαντικά, παρέχοντας σταθερό κόκκινο χρώμα και ειδική γεύση, αποτρέποντας την οξείδωση των λιπιδίων και παρέχοντας ασφαλή κατανάλωση του προϊόντος, καθώς τα νιτρώδη αναγνωρίζονται για τη βακτηριοστατική και βακτηριοκτόνο δράση τους έναντι παθογόνων βακτηρίων, όπως το παθογόνο Salmonella enterica serovar Typhimurium, τα διάφορα είδη του γένους Listeria και το Clostridium botulinum, τα οποία είναι οι κύριοι και πιο επικίνδυνοι μικροοργανισμοί που μπορούν να αναπτυχθούν στο κρέας και τα προϊόντα κρέατος. Ωστόσο, η νομοθεσία έχει επιβάλει όρια στην ποσότητα νιτρωδών αλάτων που μπορούν να προστεθούν προκειμένου να αποφευχθούν τυχόν παρενέργειες μέσω της προσθήκης υπερβολικών ποσοτήτων νιτρωδών στα τρόφιμα. Αυτές οι παρενέργειες μπορεί να αποδοθούν στον σχηματισμό επιβλαβών νιτροζαμινών που μπορούν να προκαλέσουν καρκίνο. Επιπλέον, αν και το βενζοϊκό νάτριο (SB) έχει αποτελεσματική αντιμικροβιακή δράση και χρησιμοποιείται ευρέως σε χυμούς και ποτά, έχει επίσης ορισμένες παρενέργειες στον ανθρώπινο οργανισμό, όπως επιβάρυνση του ήπατος, πρόκληση ανοσολογικών αποκρίσεων, ενώ επίσης μεταλλαξιογόνες και κυτταροτοξικές επιδράσεις έχουν αποδειχθεί in vitro σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, προκαλώντας τελικά καρκίνο. Έτσι, ο περιορισμός των χημικών συντηρητικών φαίνεται να είναι επιτακτική ανάγκη.Ακολουθώντας αυτή την τάση, σε αυτό το μέρος της έρευνας, στοχεύσαμε στη μείωση των χημικών συντηρητικών στα τρόφιμα. Αυτό επιτεύχθηκε με την ενθυλάκωση νιτρώδους καλίου (KNO2) και βενζοϊκού νατρίου (SB) σε βρώσιμη σωληνωτή κυτταρίνη (ETC), που προέρχεται από φυσικές πηγές, και σε ETC χρησιμοποιώντας πηκτή αμύλου (SG) ως ενδιάμεσο φορέα (ETC/SG). Το ενθυλακωμένο KNO2 εφαρμόστηκε σε χοιρινό και μοσχαρίσιο κρέας και χοιρινά λουκάνικα, και το ενθυλακωμένο SB εφαρμόστηκε σε χυμό πορτοκαλιού.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενθυλάκωση με τη χρήση ETC και η σταδιακή απελευθέρωση του KNO2 σε κρέας και προϊόντα αυτού επιτεύχθηκε σε μεγάλο βαθμό και κυρίως η απελευθέρωση KNO2 που ενθυλακώθηκε σε ETC/SG, ειδικά σε χαμηλές θερμοκρασίες αποθήκευσης, μπορεί να ελεγχθεί και ένα μεγάλο μέρος του συντηρητικού μπορεί να παραμείνει ενθυλακωμένο στην ETC/SG για μεγάλο χρονικό διάστημα. Επίσης, μέσω της μελέτης του μικροβιολογικού φορτίου, προσδιορίστηκε η αποτελεσματικότητα αυτής της μεθόδου συντήρησης. Τα δείγματα κρέατος και λουκάνικων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KNO2 ενθυλακωμένο σε ETC/SG, έδειξαν σημαντική αναστολή στην ανάπτυξη μικροοργανισμών ακόμη και μετά από 10 ημέρες αποθήκευσης. Επομένως, αυτή η μέθοδος οδήγησε σε επιτυχή συντήρηση των προϊόντων. Η τεχνολογία αυτή αξιολογήθηκε τεχνοοικονομικά και, σύμφωνα με εκτιμήσεις τις ερευνητικής μας ομάδας, αποδείχθηκε οικονομικά συμφέρουσα δίνοντας τη δυνατότητα για scale-up πειράματα και την εφαρμογή της διαδικασίας παραγωγής συντηρητικών με αυτή τη μέθοδο σε βιομηχανικό επίπεδο.Και στην περίπτωση του SB, η παρουσία της SG επηρέασε έντονα την απελευθέρωση του συντηρητικού, υποδηλώνοντας έτσι τη δυνατότητα ενθυλάκωσης χρησιμοποιώντας SG για τον έλεγχο του μηχανισμού απελευθέρωσης των ενθυλακωμένων ουσιών. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στην καλύτερη ενθυλάκωση των KNO2 και SB στη μήτρα πηκτής αμύλου που επιτρέπει χαμηλή κινητικότητα των μορίων των συντηρητικών. Ωστόσο, τόσο η ETC όσο και το ETC/SG θα μπορούσαν να είναι πρακτικής χρήσης ανάλογα με τον απαιτούμενο ρυθμό απελευθέρωσης των συντηρητικών. Επιτεύχθηκε σταδιακή απελευθέρωση SB στον χυμό πορτοκαλιού, καθώς το μεγαλύτερο μέρος του SB παρέμεινε εγκλωβισμένο στην ETC και ETC/SG επιτυγχάνοντας περιορισμένη απελευθέρωση. Η επεξεργασία με SB ενθυλακωμένο σε ΕTC/SG έδωσε σημαντική μείωση στο μικροβιολογικό φορτίο των χυμών, υποδεικνύοντας μια αποτελεσματική μέθοδο συντήρησης.Τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής είναι ελπιδοφόρα και χρήσιμα για πιθανές εφαρμογές, προσφέροντας τη δυνατότητα για περεταίρω έρευνα σε πολλούς τομείς. Μπορούν επίσης να έχουν μεγάλο αντίκτυπο στην παγκόσμια οικονομία, καθώς αφορούν τεχνολογίες χαμηλού κόστους που είναι φιλικές προς τον άνθρωπο και το περιβάλλον και εφαρμόζονται σε τομείς όπου το μέγεθος της αγοράς είναι αρκετά μεγάλο και υψίστης σημασίας.