Καρδιακή αμυλοείδωση ελαφριών αλυσίδων: διερεύνηση του υποκειμένου μηχανισμού καρδιοτοξικότητας για την αποκάλυψη νέων στόχων καρδιοπροστασίας

Abstract

Background and introduction: The term amyloidosis encompasses a wide spectrum of diseases characterized by protein misfolding and the deposition of amyloid fibrils in various tissues. Light chain amyloidosis (AL) is a plasma cell dyscrasia in which clonal plasma cells overproduce amyloid-forming immunoglobulin light chains, and cardiac involvement of the disease is associated with inferior survival. Treatment of AL amyloidosis relies on chemotherapeutic approaches aimed at eliminating the plasma cell clone. The prognosis of AL is based on the evaluation of cardiac markers such as natriuretic peptides or troponin levels even if the amyloid is not localized in the cardiac tissue, but to date there are no specific treatments aimed at reducing myocardial damage. In fact, standard treatments for heart failure are ineffective or intolerable in AL with cardiac involvement. The complexity in AL is based on the fact that on the one hand amyloid disrupts the tissue architecture and at the same time, the circulating light chains induce cardiotoxicity. Today, the underlying mechanisms of cardiotoxicity have not been elucidated and therefore we have not concluded on druggable targets for cardioprotection and improvement of the cardiac dysfunction.Purpose: The aim of the thesis is to compare the cardiotoxicity of light chains derived from patients with AL amyloidosis and cardiac involvement in relation to other plasma cell dyscrasias such as multiple myeloma (MM) and monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) without cardiac complications and to improve our understanding of the mechanisms of induced cardiac damage in AL. More specifically, the objectives are 1) gene sequencing and biotechnological production of full-length light chains from patients with AL and cardiac involvement, from MM, MGUS patients or non-clonal light chains from healthy volunteers (HV), 2) the investigation of the light chain induced cardiotoxicity in three distinct cell populations, 3) the investigation of toxicity mechanisms both in clinical samples and in vitro 4) the creation of an in vivo murine model of amyloidogenic light chain cardiotoxicity and 5) the establishment of an AL amyloid model suitable for the study of molecules targeting the amyloid.Methods: CD138+ clonal plasma cells were isolated from bone marrow from patients with AL and cardiac involvement (n=8), with MM (n=2) and with MGUS (n=2) and peripheral blood mononuclear cells were isolated from HV (n=2) to isolate RNA and characterize the light chain gene family repertoire. The genes encoding the clonal light chains and three light chains from HV were cloned and expressed in Shuffle E.coli cells. Light chain folding, oligomerization, and their propensity to form amyloids were assessed by circular dichroism spectroscopy, electrophoresis and electron microscopy, respectively. Primary adult murine ventricular cardiomyocytes (pAVMCs), primary fibroblasts from the myocardium and primary smooth muscle cells from aorta were exposed to various concentrations of light chains to assess cell death and investigate the mechanisms of cardiotoxicity. In parallel, circulating markers were determined in the plasma of AL patients and proteomic analysis on patient derive fat aspirates was performed to reveal potential biomarkers and molecular mechanisms associated with the tissue damage. To establish an in vivo light-chain induced cardiotoxicity model, C57BL6 male mice were randomized into 6 groups and subjected to intramyocardial administration of the three cardiotoxic and amyloidogenic light chains, the isotypic light chains from HV, or the vehicle. We characterized the model via echocardiography ultrasound evaluation of cardiac function, histological evaluation and we studied the mechanisms of the induced toxicity. Balb/c mice were randomized and injected subcutaneously with amyloid-rich solutions prepared from amyloidogenic peptides or full-length light chains of the patients to establish the AL amyloidoma model. Three molecules that are flat, lipophilic and can bind to Alzheimer's disease amyloid deposits were used as candidate radiodiagnostics to characterize the model using single photon emission tomography (SPECT) imaging and biodistribution assays.Results: We successfully produced and isolated 7 full-length light chains from AL patients, 2 from MM, 2 from MGUS and 3 from HV. All light chains were similar in conformation as a beta-sheets and in their oligomerization as a mixture of monomers and dimers. Four light chains derived from patients with AL and cardiac involvement led to cardiotoxicity in pAVMCs that was associated with their amyloid-forming property, and three of them also induced toxicity in vascular smooth muscle cells. Light chains derived from HV, MM and MGUS did not exhibit cytotoxicity. Proteomic analysis in adipose tissue of AL amyloidosis patients revealed that signaling pathways related to endoplasmic reticulum (ER) and inflammation are important. The corresponding toxicity mechanisms were also identified in vitro in pAVMCs since incubation with amyloidogenic and toxic light chains increased ER stress markers such as Bip and IRE-1a proteins which lead to increased apoptosis in kappa light chains and to increased autophagy in lambda type chains. Kappa light chains from AL, MM, and MGUS patients led to increased inflammation, suggesting that this mechanism is independent of the observed toxicity. In the circulation of patients with AL amyloidosis, an increase in cyclic guanosine monophosphate (cGMP) was detected, which was associated with an increase in the flow-mediated dilatation (FMD). This increase was also significant in patients who have AL amyloidosis with cardiac involvement and was also related to levels of cGMP release from vascular smooth muscle cells. The cytotoxic light chains led to an increase in ER stress in vascular smooth muscle cells as well. Thus, in both cell populations the use of the IRE-1a inhibitor prevented light chain-induced cytotoxicity. In vivo, intramyocardial administration of the three cytotoxic and amyloidogenic light chains resulted in cardiotoxicity with obvious histological alterations. The kappa light chain exhibited cardiotoxicity with a characteristic phenotype of cardiomyocyte apoptosis and preserved systolic function while the lambda chains led to reduced systolic function, interstitial fibrosis and increased autophagy. A common mechanism of toxicity of the administered light chains was shown to be the increase in ER stress markers. The AL amyloidoma model induced by full-length light chain amyloids from patients with AL amyloidosis was found suitable for the characterization of amyloid-binding molecules, and through its use we identified one of the three candidate radiodiagnostics as the best for detecting AL amyloids in vivo.Conclusions: Light chains deriving from patients with AL amyloidosis and cardiac involvement induce cardiotoxicity, which correlates with their amyloidogenic potential, and ER stress is an important pathway for the development of cardioprotective factors. We developed two animal models, and their use is expected to contribute to the development of cardioprotective agents and pharmacomolecules targeting the amyloid deposits.

Εισαγωγή: Ο όρος αμυλοείδωση περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα ασθενειών που χαρακτηρίζονται από λανθασμένη αναδίπλωση πρωτεϊνών και την εναπόθεση ινιδίων αμυλοειδούς σε διάφορους ιστούς. Η αμυλοείδωση ελαφριών αλυσίδων (AL) είναι μία πλασματοκυτταρική δυσκρασία στην οποία κλωνικά πλασματοκύτταρα υπερπαράγουν ελαφριές αλυσίδες ανοσοσφαιρίνης που σχηματίζουν το αμυλοειδές και η καρδιακή συμμετοχή της νόσου σχετίζεται με μειωμένη επιβίωση. Η θεραπεία της AL αμυλοείδωσης στηρίζεται σε χημιοθεραπευτικές προσεγγίσεις που στοχεύουν στην εξάλειψη του πλασματοκυτταρικού κλώνου. Η πρόγνωση της AL βασίζεται στην αξιολόγηση καρδιακών δεικτών όπως τα νατριουρητικά πεπτίδια ή η τροπονίνη ακόμη και αν το αμυλοειδές δεν εντοπίζεται στον καρδιακό ιστό, ωστόσο μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν συγκεκριμένες θεραπείες που να στοχεύουν στην μείωση της μυοκαρδιακής βλάβης. Μάλιστα, οι συνήθεις θεραπείες για την καρδιακή ανεπάρκεια είναι αναποτελεσματικές ή μη ανεκτές στην AL με καρδιακή συμμετοχή. Η πολυπλοκότητα στην AL στηρίζεται στο γεγονός ότι αφενός το αμυλοειδές διαταράσσει την αρχιτεκτονική του ιστού και παράλληλα, οι κυκλοφορούσες ελαφριές αλυσίδες επάγουν καρδιοτοξικότητα. Σήμερα, οι υποκείμενοι μηχανισμοί τοξικότητας δεν έχουν αποσαφηνιστεί και συνεπώς δεν έχουμε καταλήξει σε πιθανούς στόχους καρδιοπροστασίας για την ανάπτυξη νέων φαρμακομορίων και τη βελτίωση της λειτουργίας της καρδιάς. Σκοπός: Στόχος της διατριβής είναι η σύγκριση της καρδιοτοξικότητας των ελαφριών αλυσίδων που προέρχονται από ασθενείς με AL αμυλοείδωση και καρδιακή συμμετοχή σε σχέση με άλλες πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες όπως το πολλαπλούν μυέλωμα (ΜΜ) και η μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (MGUS) χωρίς καρδιακές επιπλοκές, ώστε να βελτιώσουμε την κατανόησή μας για τους μηχανισμούς της επαγόμενης καρδιακής βλάβης στην AL. Πιο συγκεκριμένα οι στόχοι της εργασίας είναι 1) η γονιδιακή αλληλούχηση και η βιοτεχνολογική παραγωγή ελαφριών αλυσίδων πλήρους μήκους από ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή, από ασθενείς MM, MGUS ή μη κλωνικών ελαφριών αλυσίδων από υγιείς εθελοντές (YE), 2) η διερεύνηση της πιθανής καρδιοτοξικότητας των ελαφριών αλυσίδων σε τρείς διακριτούς κυτταρικούς πληθυσμούς, 3) η διερεύνηση των μηχανισμών τοξικότητας τόσο σε κλινικά δείγματα όσο και in vitro 4) η δημιουργία ενός in vivo μοντέλου καρδιοτοξικότητας από αμυλοειδογόνες ελαφριές αλυσίδες και 5) η δημιουργία ενός μοντέλου με αμυλοείδωμα AL κατάλληλο για τη μελέτη φαρμακομορίων που στοχεύουν στο αμυλοειδές. Μέθοδοι: Πλασματοκύτταρα CD138+ απομονώθηκαν από τον μυελό των οστών από ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή (n=8), με ΜΜ (n=2) και με MGUS (n=2) και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος απομονώθηκαν από ΥΕ (n=2) για απομόνωση RNA και χαρακτηρισμό του ρεπερτορίου της οικογένειας των γονιδίων των ελαφριών αλυσίδων. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις κλωνικές ελαφριές αλυσίδες και τρείς ελαφριές αλυσίδες από ΥΕ, κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε κύτταρα Shuffle E.coli. Η αναδίπλωση των ελαφριών αλυσίδων, ο ολιγομερισμός και η τάση τους για τη δημιουργία αμυλοειδών αξιολογήθηκε μέσω φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωϊσμού, ηλεκτροφόρησης και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αντίστοιχα. Πρωτογενή καρδιομυοκύτταρα μυών (pAVMCs), πρωτογενείς ινοβλάστες από το μυοκάρδιο και πρωτογενή λεία μυϊκά κύτταρα από αορτή εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις ελαφριών αλυσίδων για την αξιολόγηση του κυτταρικού θανάτου και τη διερεύνηση των μηχανισμών καρδιοτοξικότητας. Παράλληλα, προσδιορίστηκαν δείκτες στο πλάσμα ασθενών με AL και πραγματοποιήθηκε πρωτεωμική ανάλυση λίπους ώστε να αναδειχθούν πιθανοί βιοδείκτες και μοριακοί μηχανισμοί που σχετίζονται με τη βλάβη. Για τη δημιουργία ενός in vivo μοντέλου καρδιοτοξικότητας από ελαφριές αλυσίδες, C57BL6 αρσενικοί μύες τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες και υπεβλήθησαν σε ενδοκαρδιακή χορήγηση των τριών καρδιοτοξικών και αμυλοειδογόνων ελαφριών αλυσίδων, των ισοτυπικών ελαφριών αλυσίδων από ΥΕ είτε του διαλύτη. Ακολούθησε υπερηχογραφική αξιολόγηση της καρδιακής λειτουργίας, ιστολογική αξιολόγηση της βλάβης και μελέτη του επαγόμενου μηχανισμού τοξικότητας. Mύες Balb/c τυχαιοποιήθηκαν και ενέθηκαν υποδορίως με διαλύματα πλούσια σε αμυλοειδή που είχαν παρασκευαστεί από αμυλοειδογόνα πεπτίδια ή από ελαφριές αλυσίδες πλήρους μήκους των ασθενών για τη δημιουργία του μοντέλου με AL αμυλοείδωμα. Τρία μόρια που είναι επίπεδα, λιπόφιλα και έχουν την ικανότητα να προσδένονται σε αμυλοειδείς εναποθέσεις της νόσου Alzheimer’s χρησιμοποιήθηκαν ως υποψήφια ραδιοδιαγνωστικά για τον χαρακτηρισμό του μοντέλου με τη βοήθεια απεικόνισης τομογραφίας εκπομπής μονήρους φωτονίου (SPECT) και δοκιμών βιοκατανομής. Αποτελέσματα: Πραγματοποιήθηκε επιτυχημένη παραγωγή και απομόνωση 7 ελαφριών αλυσίδων πλήρους μήκους ασθενών με AL, 2 από MM, 2 από MGUS και 3 από YE. Όλες οι ελαφριές αλυσίδες είχαν ομοιότητα στη διαμόρφωση ως βήτα πτυχωτή επιφάνεια και στον ολιγομερισμό τους ως μείγμα μονομερών και διμερών. Τέσσερεις ελαφριές αλυσίδες που προέρχονται από τους ασθενείς με AL και καρδιακή συμμετοχή οδήγησαν σε καρδιοτοξικότητα στα pAVMCs που συσχετίστηκε με την ιδιότητα αυτών να σχηματίζουν αμυλοειδή και τρείς από αυτές εμφάνισαν τοξικότητα και στα λεία μυϊκά κύτταρα. Οι ελαφριές αλυσίδες προερχόμενες από YE, MM και MGUS δεν εμφάνισαν κυτταροτοξικότητα. Η πρωτεωμική ανάλυση στα δείγματα αναρροφήματος λίπους των ασθενών με AL αμυλοείδωση ανέδειξε ως σημαντικές σηματοδοτικές οδούς αυτές που σχετίζονται με το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και τη φλεγμονή. Αντίστοιχοι μηχανισμοί τοξικότητας εντοπίστηκαν και in vitro στα καρδιομυοκύτταρα όπου η επώαση με τις αμυλοειδογόνες και τοξικές ελαφριές αλυσίδες αύξησαν τους δείκτες του ΕR στρες όπως οι πρωτεΐνες Bip και IRE-1a που στις κάπα ελαφριές αλυσίδες οδηγεί σε αυξημένη απόπτωση και στις λάμδα τύπου αλυσίδες σε αυξημένη αυτοφαγία. Οι κάπα ελαφριές αλυσίδες από ασθενείς με AL, MM και MGUS οδήγησαν σε αυξημένη φλεγμονή, υποδηλώνοντας ότι αυτός ο μηχανισμός είναι ανεξάρτητος από την παρατηρούμενη τοξικότητα. Στη κυκλοφορία των ασθενών με AL αμυλοείδωση εντοπίστηκε αύξηση της κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης (cGMP) που συσχετίστηκε με αύξηση του δείκτη αντιδραστικής υπεραιµίας (flow-mediated dilatation-FMD). Η αύξηση αυτή ήταν σημαντική και στους ασθενείς που έχουν AL αμυλοείδωση με καρδιακή συμμετοχή και επίσης σχετίστηκε με τα επίπεδα απελευθέρωσης του cGMP από τα λεία μυϊκά κύτταρα. Οι κυτταροτοξικές ελαφριές αλυσίδες οδήγησαν σε αύξηση του ER στρες και στα λεία μυϊκά κύτταρα. Έτσι και στους δύο κυτταρικούς πληθυσμούς η χρήση του αναστολέα της IRE-1a απέτρεψε την κυτταροτοξικότητα επαγόμενη από τις ελαφριές αλυσίδες. Ιn vivo, η ενδοκαρδιακή χορήγηση των τριών κυτταροτοξικών και αμυλοειδογόνων ελαφριών αλυσίδων οδήγησε σε καρδιοτοξικότητα με εμφανείς ιστολογικές αλλοιώσεις. Η κάπα ελαφριά αλυσίδα εμφάνισε καρδιοτοξικότητα με χαρακτηριστικό φαινότυπο απόπτωσης των καρδιομυοκυττάρων και διατηρημένη συσταλτική λειτουργία ενώ οι λάμδα αλυσίδες οδήγησαν σε μειωμένο κλάσμα εξώθησης, διάμεση ίνωση και αυξημένη αυτοφαγία. Κοινός μηχανισμός τοξικότητας των χορηγούμενων ελαφριών αλυσίδων αναδείχθηκε η αύξηση των δεικτών ER στρες. Το μοντέλο αμυλοειδώματος AL που περιέχει αμυλοειδή από ελαφριές αλυσίδες πλήρους μήκους από ασθενείς με AL αμυλοείδωση βρέθηκε κατάλληλο για τον χαρακτηρισμό μορίων που προσδένονται σε αμυλοειδή και η χρήση του ανέδειξε ένα από τρία υποψήφια ραδιοδιαγνωστικά ως το καλύτερο για τον εντοπισμό αμυλοειδών AL in vivo. Συμπεράσματα: Οι ελαφριές αλυσίδες που προέρχονται από ασθενείς με AL αμυλοείδωση και καρδιακή συμμετοχή επάγουν καρδιοτοξικότητα, η οποία συσχετίζεται με το αμυλοειδογόνο δυναμικό τους και το ER στρες αποτελεί σημαντικό σηματοδοτικό μονοπάτι για την ανάπτυξη καρδιοπροστατευτικών παραγόντων. Η χρήση των ζωικών μοντέλων που αναπτύχθηκαν αναμένεται να συμβάλει στην ανάπτυξη καρδιοπροστατευτικών παραγόντων και φαρμακομορίων που στοχεύουν στο αμυλοειδές.