3D mechanical metamaterial scaffolds for tissue engineering applications

Abstract

Multiphoton Lithography is a powerful technique that enables the fabrication of submicron scale structures with unprecedented resolution. By exploiting the excellent mechanical properties of the photo resin SZ2080, we were able to fabricate and characterize two main mechanical metamaterials: the auxetic reentrant honeycomb, (also known as bowtie) which shows auxetic properties and the ultra-stiff ultra- light tetrakaidekahedron (also known as Kelvin foam) which displays very high hardness and porosity by mainly consisting of empty space. By altering the unit cell architecture, those two different mechanical environments were created even though the starting material was the same. Initially, SZ2080 material was mechanically characterized with micro-indentation and the bowtie structure was optimized, fabricated, and used as scaffold for cellular studies of fibroblast cell line NIH-3T3. Cells were able to penetrate the posed of the scaffolds, deformed it and increased their proliferation. Secondly, the high autofluorescence of the polymer was addressed. For that reason, a new variant of SZ2080 was synthesized characterized by changing the photoinitiator to Sudan Black B (SBB). In that way, large non-fluorescence scaffolds were fabricated and used with Mesenchymal Stem Cells (MSCs). Confocal microscopy was then used to take z-stacks and map the whole volume of the scaffold seeded with MSCs. The third part involved the study of osteogenic differentiation of MSCs under auxetic environment. Two main proteins were monitored with confocal microscopy and PCR: the mechanotransduction protein YAP-1 and the osteogenic marker Runx2. Furthermore, the morphology of the cells was analyzed via Scanning Electron Microscopy (SEM). Results showed that the osteogenic differentiation procedure is enhanced in Auxetic environment in comparison with the flat 2D culture. Finally, 1-photon stereolithography 3D printer was used to produce large scale Triple Periodic Minimal Surface scaffolds (Swartz G structure or gyroid) with 200μm resolution unit cells and seed them with 3 different cell lines. Interestingly, no cytotoxicity was observed and cell attached and proliferated on all the scaffolds. Concluding, Auxetic scaffolds are ideal for osteogenic differentiation as they can maintain and promote the osteogenesis efficiently even after 28 days of culture. This work paves the way for the use of more complicated metamaterials into the tissue engineering field and pushes the boundaries of what light assisted manufacturing can be used for.

Η πολυφωτονική λιθογραφία είναι μια ισχυρή τεχνική που επιτρέπει την κατασκευή δομών σε mικροκλίμακα με πρωτοφανή ανάλυση. Εκμεταλλευόμενοι τις εξαιρετικές μηχανικές ιδιότητες της ρητίνης SZ2080, καταφέραμε να κατασκευάσουμε και να χαρακτηρίσουμε δύο κύρια μηχανικά μεταϋλικά: μία αυξητική δομή, (επίσης γνωστή ως bowtie) που παρουσιάζει αυξητικές ιδιότητες και το εξαιρετικά άκαμπτο υπερελαφρύ τετραδεκάεδρο (επίσης γνωστός ως αφρός Kelvin) που εμφανίζει πολύ υψηλή σκληρότητα και είναι αποτελούμενος κυρίως από κενό χώρο. Με την αλλαγή της αρχιτεκτονικής κυψελίδων μονάδας, δημιουργήθηκαν αυτά τα δύο διαφορετικά μηχανικά περιβάλλοντα, παρόλο που το αρχικό υλικό ήταν το ίδιο.Αρχικά, το υλικό SZ2080 χαρακτηρίστηκε μηχανικά με μικρο-εσοχή και η bowtie δομή βελτιστοποιήθηκε, κατασκευάστηκε και χρησιμοποιήθηκε ως ικρίωμα για κυτταρικές μελέτες της κυτταρικής σειράς ινοβλαστών NIH-3T3. Τα κύτταρα μπόρεσαν να διαπεράσουν τους πόρους των ικριωμάτων, τα παραμόρφωσαν και αύξησαν τον πολλαπλασιασμό τους.Δεύτερον, αντιμετωπίστηκε ο υψηλός αυτοφθορισμός του πολυμερούς. Για το λόγο αυτό, συντέθηκε μια νέα παραλλαγή του SZ2080 που χαρακτηρίζεται από την αλλαγή του φωτοεκκινητή σε Sudan Black B (SBB). Με αυτόν τον τρόπο, κατασκευάστηκαν μεγάλα ικριώματα μη φθορισμού και χρησιμοποιήθηκαν με Μεσεγχυματικά Βλαστοκύτταρα (MSC). Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ομοεστιακή μικροσκοπία για τη λήψη στοίβων z και τη χαρτογράφηση ολόκληρου του όγκου του ικριώματος που σπάρθηκε με MSC.Το τρίτο μέρος αφορούσε τη μελέτη της οστεογονικής διαφοροποίησης των MSCs σε αυξητικό περιβάλλον. Δύο κύριες πρωτεΐνες παρακολουθήθηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία και PCR: η πρωτεΐνη μηχανο-επαγωγής YAP-1 και ο οστεογενής δείκτης Runx2. Επιπλέον, η μορφολογία των κυττάρων αναλύθηκε μέσω Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (SEM). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η διαδικασία οστεογονικής διαφοροποίησης ενισχύεται στο αυξητικό περιβάλλον σε σύγκριση με την επίπεδη 2D καλλιέργεια.Τέλος, ο τρισδιάστατος εκτυπωτής στερεολιθογραφίας 1 φωτονίου χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή ικριωμάτων τριπλής περιοδικής ελάχιστης επιφάνειας μεγάλης κλίμακας (δομή Swartz G ή γυροειδής) με κελιά μονάδας ανάλυσης 200μm και έγινε καλλιέργεια με 3 διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Είναι ενδιαφέρον ότι δεν παρατηρήθηκε κυτταροτοξικότητα και τα κύτταρα προσαρτήθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν σε όλα τα ικριώματα.Συμπερασματικά, τα αυξητικά ικριώματα είναι ιδανικά για οστεογονική διαφοροποίηση καθώς μπορούν να διατηρήσουν και να προωθήσουν αποτελεσματικά την οστεογένεση ακόμη και μετά από 28 ημέρες καλλιέργειας. Αυτή η εργασία ανοίγει το δρόμο για τη χρήση πιο περίπλοκων μεταϋλικών στο πεδίο της μηχανικής ιστών και ωθεί τα όρια για το τι μπορεί να χρησιμοποιηθεί η κατασκευή με τη βοήθεια φωτός.