Development of methodology for the study of synovial fluid and its application in regenerative medicine in osteoarthritis

Abstract

Osteoarthritis (OA) is a chronic, progressive, degenerative joint disease, characterized by the breakdown of articular cartilage, causing pain, swelling, and limited joint mobility. OA is the most common major disabling disease in humans and is an important cause of severe economic burden to the National Health Systems, also being one of the most common challenges in equine orthopedics, causing careerlimiting or, even worse, career-ending lameness. Synovial fluid (SF), a biological material of central importance for living organisms, seems to be one of the crucial components for the proper function and well-being of the joints. SF is an exceptionally challenging biological material to study, and its characteristic properties derive from its unique molecular structure (namely the hyaluronic acid (HA)-proteoglycan complex) and in normal conditions, protects the articular cartilage from load, absorbing at the same time the pressure which is applied to the joints during movement, lubricating the cartilage surfaces and being the source of its nutrients. For the first time, a detailed experimental protocol was established here for the successful quantitative study of equine SF, thus enabling the collection of fully reproducible, free from most systematic errors results in a holistic, systematic and thorough manner, at 25 °C and 37.5 °C (physiological equine body temperature), based on an interdisciplinary approach and combining detailed rheological, cytological and biochemical analyses. A fairly adequate number of a total of 130 equine SF samples (44 healthy and 86 pathological) were fully analyzed in this manner, representing two different horse breeds (Warmblood and Thoroughbred) and three different joints (metacarpophalangeal, intercarpal and interphalangeal), in order to initiate statistical analysis of the results. Steady state studies confirmed that equine SF is a typical non-Newtonian, strongly shear thinning fluid that can be fitted well with existing empirical models, especially the Williamson one with η0 of the order of magnitudes of 50-500 mPa·s in the healthy state, and dropping with increasing temperature. Oscillatory measurements could be fitted satisfactorily with the Maxwell model and asserted that equine SF behaves like a classic viscoelastic fluid; its properties were found to depend strongly on applied frequency, behaving like a viscous fluid at lower frequencies and transforming into a fragile, transient, semi-flexible 3D gel-like network at higher frequencies; for example at typical walking frequency the elastic G' and viscous G" moduli in the healthy state were found to be of the order of magnitude of 70 mPa and 90 mPa respectively. Impressive application of the Cox-Merz rule in the vast majority of cases substantiated further the good quality of the results and widened the window of frequencies that can be studied successfully.Comparative analysis allowed a number of possible interesting effects to emerge. Firstly, the quantitative properties of SF in the healthy state appear to be joint-depend with the magnitude of SF properties following the order: metacarpophalangeal joint > intercarpal joint > interphalangeal joint, implying subtle differences in the biological role of SF in the different joints of the body as well as different predispositions for OA. Secondly the quantitative properties of SF in the healthy state seem to be also dependent on the horse breed, with the Warmblood horses being characterized by higher values of SF properties, compared to the athletic Thoroughbred race horses which are surprisingly characterized by low values of SF properties; it is plausible that this is an phenotypical outcome of the different genetic make ups of the two breeds. Thirdly each SF from a healthy joint of a specific animal is found to have its own identity which remains constant over the course of the study time of a couple of months, presumably due to homeostatic mechanisms. Encouragingly, repeated arthrocentesis of the same healthy joint does not appear to affect in any noticeable manner the quality of SF. Furthermore, most of the time, but not always, the left and right healthy joints of the same animal contain SF with near identical properties.OA equine joints were characterized by much higher standard deviations compared to healthy ones, possibly reflecting the various stages of OA. In the majority of cases, OA SF possessed significantly lower rheological properties compared to the healthy onesfor the same breed and joint type, accompanied by a concomitant drop in the HA concentration. The quality of SF from OA joints was found to deteriorate further with time in the course of 1+ year. Left and right OA joints of the same animal were regularly found to contain SF with markedly different properties, possibly reflecting more or less advanced OA in the left and right joints of the same body. Apart from Sex and Breed, for both healthy and OA SF, Age and Weight factors affected its rheology.In vivo treatment of equine OA joints with a single, injectable, HA-based widely-used viscosupplementation medical device (Product 1) showed a positive effect on SF in the short term (up to a week), however no positive effects were observed in the medium to long term (up to 8+ weeks). On the other hand, similar in vivo treatment of healthy equine joints resulted in no positive effect in the short to medium term, but a mild positive effect in the longer term (8+ weeks); this might be indicative of a regenerative ability on the surrounding tissues, helping to protect them from the onset of OA. In contrast, in vivo treatment of equine OA joints with the popular injection of corticosteroids (betamethasone BM) caused significant deterioration of SF in the short to medium term, whilst they started recovering in the longer term (8+ weeks). It seems likely that the painkiller BM caused chemical breakdown of SF components in the short to medium term. Comparison of healthy as well as OA equine and human SF showed that the human SF, surprisingly, has 1 to 2 orders of magnitude higher rheological properties compared to the equine ones, but qualitatively the same features.The findings of the present research produce a quantitative database allowing this approach to become a complementary tool in medical and veterinary practice, for assessing the state of the joint, propensity for OA, delaying the onset of OA, evaluating in vivo in a quantitative manner therapeutic interventions in a personalized and joint-specific manner, as well as designing new therapeutic minimally invasive interventions for regeneration of the joint tissues.

Η οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) είναι μία χρόνια, προοδευτική, εκφυλιστική ασθένεια των αρθρώσεων, η οποία χαρακτηρίζεται από τη καταστροφή του αρθρικού χόνδρου, προκαλώντας πόνο, οίδημα και περιορισμένη κινητικότητα στις αρθρώσεις. Στους ανθρώπους, η ΟΑ αποτελεί την πιο κοινή σοβαρή ασθένεια που προκαλεί κινητικά προβλήματα, επιβαρύνοντας σημαντικά τα εθνικά συστήματα υγείας. Παράλληλα, συνιστά μεγάλη πρόκληση στην ορθοπεδική των ίππων, διότι μπορεί να αποτελέσει την αιτία για περιορισμό της καριέρας ενός αθλητή-ίππου, ακόμη και τερματισμό της, λόγω χωλότητας. Το αρθρικό υγρό (ΑΥ), που είναι ένα σημαντικό βιολογικό υλικό για τους ζωντανούς οργανισμούς, αποτελεί ένα από τα πιο κρίσιμα συστατικά των αρθρώσεων για τη σωστή λειτουργία και ευεξία τους. Το ΑΥ είναι ένα εξαιρετικά απαιτητικό βιολογικό υλικό ως προς την εξέτασή του, καθώς οι χαρακτηριστικές ιδιότητές του πηγάζουν από τη ξεχωριστή μοριακή δομή που διαθέτει, ήτοι το σύμπλεγμα υαλουρονικού οξέος – πρωτεογλυκανών. Σε κανονικές συνθήκες, το ΑΥ προστατεύει τον αρθρικό χόνδρο από το βάρος που δέχεται, απορροφώντας τις πιέσεις που εφαρμόζονται πάνω του λόγω της κίνησης, λιπαίνοντας παράλληλα τις επιφάνειες του, αποτελώντας ταυτόχρονα και την πηγή των συστατικών του.Στη παρούσα μελέτη, σχεδιάστηκε και εφαρμόστηκε για πρώτη φορά ένα λεπτομερές πειραματικό πρωτόκολλο, με σκοπό τον όσο το δυνατό πιο αξιόπιστο ποσοτικό ρεολογικό χαρακτηρισμό του αρθρικού υγρού των ίππων, επιτρέποντας τη συλλογή πλήρως αναπαραγόμενων αποτελεσμάτων απαλλαγμένων από αρκετά συστηματικά λάθη. Πραγματοποιήθηκε δηλαδή μία ολιστική ρεολογική μελέτη με συστηματικό και εμπεριστατωμένο τρόπο, στους 25 °C (θερμοκρασία δωματίου) και 37.5 °C (φυσιολογική θερμοκρασία του ίππου), βασισμένη σε μια διεπιστημονική προσέγγιση συνδυάζοντας λεπτομερείς ρεολογικές, κυτταρολογικές και βιοχημικές αναλύσεις. Ένας αρκετά επαρκής αριθμός συνολικά 130 δειγμάτων ΑΥ ίππων (44 υγιή και 86 παθολογικά) αναλύθηκαν με αυτόν τον τρόπο, περιλαμβάνοντας 2 φυλές ίππων (Warmblood and Thoroughbred) και 3 τύπους αρθρώσεων (μετακάρπιοφαλαγγική, μεσοκαρπική και 2η -μεσοφαλαγγική), προκειμένου να επιτραπεί η στατιστική τους ανάλυση.Από μελέτες σταθερής κατάστασης επιβεβαιώθηκε ότι το ΑΥ των ίππων είναι μηΝευτωνικό υγρό, με ισχυρή συμπεριφορά διατμητικής λέπτυνσης που μπορεί να προσoμοιωθεί καλά με εμπειρικά ρεολογικά μοντέλα, όπως το Williamson, με μηδενικό ιξώδες η0 της τάξης μεγέθους του 50-500 mPa·s στην υγιή του κατάσταση, το οποίο μειώνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας. Οι ταλαντευτικές μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν μπορούν να προσομοιωθούν ικανοποιητικά από το μοντέλο του Maxwell και να βεβαιώσουν ότι το ΑΥ των ίππων συμπεριφέρεται σαν ένα κλασικό ιξωδοελαστικό υλικό˙ δηλαδή, οι ιδιότητές του βρέθηκαν να εξαρτώνται ισχυρά από τη συχνότητα ταλάντωσης της εφαρμοζόμενης τάσης παραμόρφωσης, συμπεριφερόμενο ως ιξώδες υγρό στις χαμηλές συχνότητες, το οποίο μετατρέπεται σε ένα παροδικό, εύθραυστο, ευέλικτο τρισδιάστατο δίκτυο που μοιάζει με γέλη στις υψηλές συχνότητες. Για παράδειγμα, στην τυπική συχνότητα βαδίσματος, το μέτρο ελαστικότητας G' και το μέτρο αποθήκευσης G" στην υγιή κατάσταση βρέθηκαν να είναι της τάξης μεγέθους των 70 mPa και 90 mPa αντίστοιχα. Η εντυπωσιακή εφαρμογή του κανόνα των Cox-Merz, στη συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων, τεκμηρίωσε περαιτέρω την καλή ποιότητα των αποτελεσμάτων και διεύρυνε το παράθυρο των συχνοτήτων που μπορούν να μελετηθούν αξιόπιστα.Με τη συγκριτική ανάλυση προέκυψε μια σειρά από πιθανά ενδιαφέροντα αποτελέσματα. Κατ’ αρχάς, οι ποσοτικές ρεολογικές ιδιότητες του ΑΥ στην υγιή του κατάσταση φαίνεται να εξαρτώνται από τον τύπο της άρθρωσης ακολουθώντας την εξής σειρά: μετακαρποφαλαγγική > μεσοκαρπική > μεσοφαλαγγική άρθρωση, υποδηλώνοντας ανεπαίσθητες διαφορές στον βιολογικό ρόλο του ΑΥ στις διάφορες αρθρώσεις του σώματος καθώς και διαφορετικές προδιαθέσεις για ΟΑ. Δεύτερον, οι ποσοτικές ιδιότητες του ΑΥ στην υγιή του κατάσταση φαίνεται επίσης να εξαρτώνται από τη φυλή των ίππων, με τα Warmblood να χαρακτηρίζονται από υψηλότερες τιμές ιδιοτήτων, σε σύγκριση με τους αθλητικούς ίππους ιπποδρομιών Thoroughbred που χαρακτηρίζονται από χαμηλές τιμές ιδιοτήτων ΑΥ. Αυτό το φαινοτυπικό αποτέλεσμα είναι εύλογο ότι είναι απόρροια της διαφορετικής γενετικής σύνθεσης των δύοφυλών. Τρίτον, κάθε δείγμα ΑΥ από υγιή άρθρωση ενός συγκεκριμένου ίππου βρέθηκε να έχει τη δική του ταυτότητα, η οποία παραμένει σταθερή εντός ενός χρονικού πλαισίου μελέτης 2 μηνών, πιθανώς λόγω ομοιοστατικών μηχανισμών. Είναι ενθαρρυντικό το γεγονός ότι η επαναλαμβανόμενη αρθροκέντηση της ίδιας υγιούς άρθρωσης δεν φαίνεται να επηρεάζει με κανένα αξιοσημείωτο τρόπο την ποιότητα του ΑΥ που περιέχει. Επιπλέον, τις περισσότερες φορές, αλλά όχι πάντα, οι αρθρώσεις του αριστερού και δεξιού άκρου του ίδιου ίππου περιέχει ΑΥ με σχεδόν πανομοιότυπες ιδιότητες.Οι μέσες τιμές των ρεολογικών παραμέτρων των οστεοαρθριτικών αρθρώσεων των ίππων χαρακτηρίστηκαν από πολύ υψηλότερες τυπικές αποκλίσεις σε σύγκριση με αυτών των υγιών, αντανακλώντας πιθανώς τα διάφορα στάδια της ασθένειας. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, τα δείγματα οστεοαρθριτικού αρθρικού υγρού είχαν σημαντικά χαμηλότερες ρεολογικές ιδιότητες σε σύγκριση με τα υγιή για την ίδια φυλή και τύπο άρθρωσης, συνοδευόμενα από ταυτόχρονη πτώση της συγκέντρωσης υαλουρονικού οξέος. Η ποιότητα του ΑΥ από οστεοαρθριτικές αρθρώσεις βρέθηκε να επιδεινώνεται περαιτέρω με την πάροδο του χρόνου κατά τη διάρκεια 1+ έτους. Οι οστεοαρθρικές αρθρώσεις του αριστερού και δεξιού άκρου του ίδιου ζωικού μοντέλου βρέθηκαν να περιέχουν ΑΥ με αξιοσημείωτες διαφορετικές ιδιότητες, που πιθανώς να αντανακλούν περισσότερο ή λιγότερο προχωρημένη ΟΑ στις αντίστοιχεςαρθρώσεις του ίδιου οργανισμού. Τόσο για τα υγιή, όσο και για τα οστεοαρθριτικά δείγματα του αρθρικού υγρού, εκτός από τις ανεξάρτητες μεταβλητές του Φύλου και της Φυλής, η Ηλικία και το Βάρος επηρεάζουν επίσης τη ρεολογία τους.Η in vivo θεραπεία των οστεοαρθιτικών αρθρώσεων των ίππων με ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο ενέσιμο ιατρικό σκεύασμα ιξωδοαναπλήρωσης με βάση το υαλουρονικό οξύ (Προϊόν 1) έδειξε θετική επίδραση στο ΑΥ βραχυπρόθεσμα (έως και μία εβδομάδα), ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν θετικά μεσοπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα αποτελέσματα (έως 8+ εβδομάδες). Από την άλλη πλευρά, παρόμοια in vivo παρέμβαση σε υγιείς αρθρώσεις ίππων, δεν είχε θετικό αποτέλεσμα βραχυπρόθεσμα έως και μεσοπρόθεσμα, αλλά ήπιο θετικό αποτέλεσμα μακροπρόθεσμα (8+ εβδομάδες). Αυτό μπορεί να είναι ενδεικτικό μίας αναγεννητικής ικανότητας στους περιβάλλοντες ιστούς, βοηθώντας στην προστασία τους από την εμφάνιση ΟΑ. Αντίθετα, η in vivo θεραπεία των οστεοαρθρικών αρθρώσεων των ίππων με το δημοφιλές ενέσιμο σκεύασμα κορτικοστεροειδών (βηταμεθαζόνη) προκάλεσε σημαντική επιδείνωση του ΑΥ βραχυπρόθεσμα έως μεσοπρόθεσμα, ενώ άρχισε να αναρρώνει μακροπρόθεσμα (8+ εβδομάδες). Φαίνεται πιθανό ότι το παυσίπονο βηταμεθαζόνη προκάλεσε χημική διάσπαση των συστατικών του ΑΥ βραχυπρόθεσμα έως μεσοπρόθεσμα. Η ποσοτική σύγκριση του υγιούς καθώς και του οστεοαρθριτικού ΑΥ των ίππων με αυτό του ανθρώπου, έδειξε ότι το ανθρώπινο ΑΥ, παραδόξως, έχει 1 έως 2 τάξεις μεγέθους υψηλότερες τιμές ρεολογικών ιδιοτήτων σε σύγκριση με αυτό των ίππων, αλλά με τα ίδια ποιοτικάχαρακτηριστικά.Τα ευρήματα της παρούσας έρευνας παράγουν μια ποσοτική βάση δεδομένων ρεολογικών τιμών που επιτρέπει αυτή η προσέγγιση να γίνει ένα συμπληρωματικό εργαλείο στην ιατρική και κτηνιατρική πρακτική, για την αξιολόγηση της κατάστασης της άρθρωσης, την τάση της για εμφάνιση ΟΑ, την καθυστέρηση εμφάνισης ΟΑ, την αξιολόγηση ποσοτικά in vivo θεραπευτικών παρεμβάσεων με εξατομικευμένο τρόπο, ειδικά για τις αρθρώσεις, καθώς και για το σχεδιασμό νέων θεραπευτικών, ελάχιστα επεμβατικών παρεμβάσεων για την αναγέννηση των αρθρικών ιστών.