Μελέτη των νοσημάτων και παθολογικών καταστάσεων που συνυπάρχουν με τη λεϊσμανίωση (Leishmania infantum) του σκύλου και της επίδρασής τους στην κλινική εικόνα και τα εργαστηριακά ευρήματα της νόσου

Abstract

Canine leishmaniosis (CanL) due to Leishmania infantum is a common disease of major Veterinary and Public Health importance, in South Europe, North Africa, parts of Asia, Latin America and in specific dog populations in North America. In endemic areas, except for North America, female sandflies are the vectors responsible for the transmission of the parasite, and dogs are usually the main domestic reservoir. The outcome of canine infection can be the local elimination of the parasite at the site of the infectious bite (self-cure), the containment of the parasite at the site of inoculation (localized infection), the dissemination of the parasite that does not result in clinical signs or laboratory abnormalities (asymptomatic disseminated infection) or the development of CanL. This outcome depends on numerous factors, including the effects of sandfly saliva, the frequency and intensity of exposure to infectious bites, the virulence of the parasite strain, and the innate and adaptive immune responses of the dog. Considering the latter, an effective, Th1-like, cell-mediated, parasite-specific immune response, leading to effective killing of L. infantum by infected macrophages characterizes the disseminated asymptomatic infections, whereas, in CanL the above mechanism is compromised and a non-protective, exaggerated humoral immune response typically occurs. As expected for every common disease, comorbidities are frequently encountered in dogs with leishmaniosis. However, the prevalence of some of them, mainly of neoplastic, infectious, and parasitic etiology, is higher than would have been expected from mere chance. Proposed explanations for this increased prevalence include: a) residing in areas where both CanL and other vector-borne diseases are endemic; b) inadequate prevention against vectors of CanL (sandflies) and other vector-borne diseases (ticks, fleas, mosquitos); c) concurrent transmission of L. infantum and other vector-borne disease agents by ticks and fleas; d) breed predisposition to CanL and to other diseases, such as lymphoma in Boxers and Rottweilers; e) CanL-induced immunosuppression leading to the exacerbation of other diseases; and, f) the influence of the comorbidities to the immune system, that may render a previously infected but resistant dog to become susceptible and develop CanL. Although multiple studies compare the prevalence of comorbidities between CanL-seropositive and seronegative dogs, and fewer studies between dogs with and without CanL, there is a lack of information on their relative prevalence among non-infected dogs, infected dogs without CanL and dogs with CanL. The aim of the present study was to compare the prevalence of comorbidities among dogs that are not infected by L. infantum, dogs that are infected but do not present CanL and dogs with CanL, and thus to investigate if these comorbidities are independent risk factors for the infection and/or for the development of CanL, and to evaluate their impact on the clinical presentation and on the results of laboratory examinations in dogs with CanL.A total of 111 dogs, older than one year, non-vaccinated against CanL, were used and they were allocated into three groups: group A (n=18) included dogs that were not infected by L. infantum, group B (n=52) included dogs that were infected by L. infantum but did not present CanL, and group C (n=41) included dogs with CanL. Using a structured questionnaire, the following information was obtained for each dog: a) sex and neuter status; b) breed; c) age; d) body weight; e) utility; f) living area; g) presence of dense vegetation in a radius of 100 m from the living area; h) lifestyle during the period of sandfly activity; i) diet; j) previous pregnancies (female dogs); k) previous administration of systemic glucocorticoids or other immunosuppressive medications; l) routine vaccinations; m) prevention for endoparasites (including dirofilariosis due to Dirofilaria immitis) and ectoparasites; n) use of insect repellents on the dog; and o) use of insecticides in the living area. A thorough physical examination was performed, and all clinical signs were recorded in a specific form that included, among others, all clinical signs that have been associated with CanL. Biological samples collected included whole blood in EDTA, serum, urine, feces, lymph node aspiration material, bone marrow, cutaneous cytology preparations, skin scrapings, skin biopsies and conjunctival swabs.Laboratory examinations included complete blood count with differential cell count, serum biochemistry, urinalysis (including measurement of urine protein/creatinine ratio), fecal parasitology, modified Knott’s test, microscopic examinations (capillary blood, buffy coat, lymph node, bone marrow, and conjunctival smears), qualitative serology for D. immitis, Anaplasma phagocytophilum/A. platys, Borrelia burgdorferi and Ehrlichia canis, indirect immunofluorescence antibody testing for L. infantum, ELISA for Babesia spp. and Neospora caninum, real-time PCR for L. infantum (bone marrow, skin biopsy, and conjunctival swab samples), and leishmanin skin test. Signalment, historical data, clinical and laboratory findings, and comorbidities were compared between non-infected (group A) and infected (groups B and C, combined) dogs, as well as between infected dogs without (group B) or with (group C) CanL, by Pearson’s χ2 or Fisher’s exact test (categorical data), two-sample t-test (normally distributed continuous data) or Mann-Whitney U test (non-normally distributed continuous data). All variables with a P value ≤ 0.25 in the univariate analyses were selected as candidates for initial logistic regression models. The initial models were subsequently reduced in a stepwise manner, until only variables significant at P < 0.05 remained. The latter analysis was also applied to investigate the influence of comorbidities on the prevalence and the severity of clinical signs, on the prevalence of laboratory abnormalities and on the absolute values of the laboratory parameters of group C dogs. In univariate analysis of the signalment, the only difference among groups was that mongrels were more common in group C compared to group B (P = 0.002). Considering the historical information, the only significant differences found were that the probability of no prevention against endoparasites, of inadequate prevention against dirofilariosis, and of no use of insect repellents was significantly higher (P = 0.003, P = 0.021, and P = 0.004, respectively) among dogs with CanL compared to infected dogs without CanL, whereas the reverse was true for the use of environmental insecticides (P < 0.001).The most common comorbidities found in the three groups of dogs included seropositivity for N. caninum and for Babesia spp., both being more common in dogs with CanL (group C) compared to infected dogs without CanL (group B; P = 0.001 and P < 0.001, respectively).Logistic regression model comparing signalment, historical information and comorbidities between non-infected (group A) and infected (groups B and C, combined) showed that none of these variables was an independent risk factor for infection by L. infantum. However, when infected dogs with (group C) and without (group B) CanL were compared, it was found that being a mongrel [P = 0.003; odds ratio (OR): 11.2; 95% confidence interval (CI): 2.3-54.6], not receiving prevention for dirofilariosis (P = 0.011; OR: 26.5; 95% CI: 2.1-334.6), being seropositive for N. caninum (P = 0.001; OR: 17.1; 95% CI: 3.3-87.8), and being seropositive for Babesia spp. (P <0.001; OR: 37.6; 95% CI: 8.1-173.8), were independent risk factors for the development of CanL.Dogs with CanL that were seropositive for N. caninum were less likely to have increased activity of creatine kinase and they had lower activity of the enzyme in their serum compared to dogs with CanL that were seronegative for N. caninum. Also, dogs with CanL that were seropositive for Babesia spp. were more likely to have increased globulins and less likely to have monocytopenia and hypocalcemia.

Η λεϊσμανίωση του σκύλου που οφείλεται στη Leishmania infantum είναι συχνό νόσημα με ιδιαίτερη σημασία, όχι μόνο για την Κτηνιατρική αλλά και για τη Δημόσια Υγεία, στις χώρες της Νότιας Ευρώπης και της Βόρειας Αφρικής, σε περιοχές της Ασίας, στη Λατινική Αμερική και σε συγκεκριμένες ομάδες σκύλων στη Βόρεια Αμερική. Στις περιοχές όπου η νόσος είναι ενδημική, με εξαίρεση τη Βόρεια Αμερική, η μετάδοση του πρωτόζωου γίνεται με τα νύγματα των θηλυκών φλεβοτόμων, ενώ οι σκύλοι αποτελούν, συνήθως, την κύρια δεξαμενή του στη φύση. Η έκβαση της μόλυνσης ενός σκύλου μπορεί να είναι η τοπική εξουδετέρωση του παρασίτου (αυτοΐαση), η παραμονή του πρωτόζωου στο σημείο ενοφθαλμισμού (εντοπισμένη μόλυνση), η διασπορά του στα εσωτερικά όργανα που όμως δε συνοδεύεται από την εμφάνιση συμπτωμάτων ή εργαστηριακών μεταβολών (γενικευμένη ασυμπτωματική μόλυνση) ή η εμφάνιση της νόσου. Αυτό εξαρτάται από πλήθος παραγόντων όπως είναι η επίδραση του σάλιου των φλεβοτόμων, η συχνότητα και ο βαθμός έκθεσης στη L. infantum, η λοιμογόνος ικανότητα του στελέχους του πρωτόζωου και η ανοσολογική απάντηση του σκύλου (έμφυτη και επίκτητη) στη μόλυνση. Αναφορικά με την τελευταία, οι γενικευμένες ασυμπτωματικές μολύνσεις χαρακτηρίζονται από την τύπου-1, ειδική για το πρωτόζωο, ενεργοποίηση της κυτταρικής ανοσίας που επιτρέπει την αποτελεσματική εξουδετέρωση της L. infantum από τα μολυσμένα μακροφάγα. Αντίθετα, σε σκύλους με λεϊσμανίωση, η κυτταρική ανοσία είναι ανεπαρκής, ενώ παράλληλα διαπιστώνεται υπέρμετρη ενεργοποίηση της, μη προστατευτικής, χυμικής ανοσίας. Όπως είναι αναμενόμενο για οποιοδήποτε συχνό νόσημα, όπως η λεϊσμανίωση του σκύλου, η συνύπαρξη άλλων νοσημάτων και παθολογικών καταστάσεων δεν είναι σπάνια. Ωστόσο, η συχνότητα ορισμένων από αυτά, ιδιαίτερα εκείνων που είναι νεοπλασματικής, λοιμώδους ή παρασιτικής αιτιολογίας, είναι μεγαλύτερη από ότι θα αναμένονταν λόγω τυχαίας συνύπαρξης. Αυτό έχει αποδοθεί σε ποικίλους μηχανισμούς στους οποίους συμπεριλαμβάνονται: α) η διαβίωση σε περιοχές όπου η λεϊσμανίωση και άλλα νοσήματα που μεταδίδονται με αρθρόποδα ή έντομα είναι ενδημικά, β) η ανεπαρκής εφαρμογή προληπτικών μέτρων έναντι των μεταδοτών της λεϊσμανίωσης (φλεβοτόμοι) και άλλων λοιμωδών και παρασιτικών νοσημάτων (κρότωνες, ψύλλοι, κουνούπια), γ) η ταυτόχρονη μετάδοση της L. infantum και άλλων μικροοργανισμών μέσω των ψύλλων και των κροτώνων, δ) η προδιάθεση ορισμένων φυλών στη λεϊσμανίωση και σε άλλα νοσήματα (π.χ. στο λέμφωμα στην περίπτωση των Boxer και των Rottweiler), ε) η ανοσοκαταστολή λόγω της λεϊσμανίωσης που αυξάνει την πιθανότητα εμφάνισης άλλων νοσημάτων, και στ) η επίδραση των τελευταίων στο ανοσοποιητικό σύστημα, που έχει ως αποτέλεσμα μολυσμένοι σκύλοι που προηγουμένως ήταν ανθεκτικοί να γίνουν ευαίσθητοι και να εμφανίσουν τη νόσο. Παρά την πληθώρα μελετών όπου συγκρίθηκε η συχνότητα των συνυπαρχόντων νοσημάτων και παθολογικών καταστάσεων μεταξύ σκύλων που ήταν ορολογικά θετικοί ή αρνητικοί για τη λεϊσμανίωση, και το σχετικά μικρότερο αριθμό μελετών όπου συγκρίθηκε μεταξύ σκύλων με ή χωρίς τη νόσο, μέχρι σήμερα δεν έχει γίνει αντίστοιχη σύγκριση μεταξύ σκύλων που δεν είναι μολυσμένοι από L. infantum, μολυσμένων σκύλων χωρίς τη νόσο και σκύλων με λεϊσμανίωση. Οι στόχοι της μελέτης αυτής ήταν να συγκριθεί η συχνότητα διάφορων νοσημάτων και παθολογικών καταστάσεων μεταξύ των μη μολυσμένων σκύλων, των μολυσμένων σκύλων χωρίς τη νόσο και των σκύλων με λεϊσμανίωση, ώστε να διαπιστωθεί αν τα πρώτα αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου για τη μόλυνση ή/και την εμφάνιση της νόσου, και η μελέτη της επίδρασής τους στην κλινική εικόνα και στα αποτελέσματα των εργαστηριακών εξετάσεων σκύλων με λεϊσμανίωση.Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 111 σκύλοι με ηλικία μεγαλύτερη από ένα έτος που δεν ήταν εμβολιασμένοι έναντι της L. infantum. Με βάση τα κλινικά ευρήματα και τα αποτελέσματα των εργαστηριακών εξετάσεων, οι σκύλοι της μελέτης χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: η ομάδα Α (n=18) περιλάμβανε σκύλους που δεν ήταν μολυσμένοι από L. infantum, η ομάδα B (n=52) περιλάμβανε μολυσμένους σκύλους που δεν εμφάνιζαν τη νόσο και η ομάδα Γ (n=41) σκύλους με λεϊσμανίωση. Με τη χρήση ειδικά διαμορφωμένου ερωτηματολόγιου συλλέχθηκαν, για κάθε σκύλο, οι παρακάτω πληροφορίες: α) το φύλο και αν ήταν ή όχι γεννητικά ακέραιος, β) η φυλή, γ) η ηλικία, δ) το σωματικό βάρος, ε) η χρησιμότητα, στ) η περιοχή διαβίωσης, ζ) η παρουσία πυκνής βλάστησης σε ακτίνα 100 m από την περιοχή διαβίωσης, η) οι συνθήκες διαβίωσης την περίοδο δραστηριότητας των φλεβοτόμων, θ) η διατροφή, ι) οι προηγούμενες εγκυμοσύνες (θηλυκοί σκύλοι), ια) η προηγούμενη χορήγηση γλυκοκορτικοειδών ή άλλων ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ιβ) οι εμβολιασμοί, ιγ) η προληπτική αγωγή για τα ενδοπαράσιτα, συμπεριλαμβανόμενης της διροφιλαρίωσης από Dirofilaria immitis, και για τα εξωπαράσιτα, ιδ) η χρήση εντομοαπωθητικών στο σκύλο, και ιε) η χρήση εντομοκτόνων στο χώρο διαβίωσης. Ακολουθούσε πλήρης κλινική εξέταση και καταγραφή όλων των συμπτωμάτων σε ειδικό δελτίο, όπου συμπεριλαμβάνονταν όλα τα συμπτώματα που έχουν συνδεθεί με τη λεϊσμανίωση του σκύλου. Στα βιολογικά υλικά που πάρθηκαν από τους σκύλους της μελέτης περιλαμβάνονται το ολικό αίμα σε αντιπηκτικό EDTA, ο ορός του αίματος, τα ούρα τα κόπρανα, ο οπός λεμφογαγγλίου, ο μυελός των οστών, το υλικό για κυτταρολογική εξέταση του δέρματος, τα ξέσματα από το δέρμα, οι βιοψίες του δέρματος και το υλικό επιφανειακής απόξεσης του επιπεφυκότα.Οι εργαστηριακές εξετάσεις περιλάμβαναν τη γενική αίματος και το λευκοκυτταρικό τύπο, την πλήρη βιοχημική εξέταση στον ορό του αίματος, την ανάλυση των ούρων με μέτρηση του λόγου πρωτεΐνες/κρεατινίνη, την παρασιτολογική εξέταση των κοπράνων, την τροποποιημένη εξέταση κατά Knott, τη μικροσκοπική εξέταση επιχρισμάτων τριχοειδικού αίματος, επιχρίσματος από τη στοιβάδα λευκών αιμοσφαιρίων-αιμοπεταλίων του αιματοκρίτη, λεμφογαγγλίου, μυελού των οστών, και επιπεφυκότα, την ποιοτική ορολογική εξέταση για D. immitis, Anaplasma phagocytophilum/A. platys, Borrelia burgdorferi και Ehrlichia canis, τον έμμεσο ανοσοφθορισμό για L. infantum, την ELISA για Babesia spp. and Neospora caninum, την real-time PCR για L. infantum στο μυελό των οστών, τις βιοψίες δέρματος και το επίχρισμα του επιπεφυκότα και την ενδοδερμική δοκιμή της λεϊσμανίνης. Τα στοιχεία ταυτότητας, το ιστορικό, τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα, και τα συνυπάρχοντα νοσήματα συγκρίθηκαν μεταξύ των μη μολυσμένων (ομάδα Α) και των μολυσμένων (ομάδες Β και Γ), καθώς και μεταξύ των μολυσμένων σκύλων χωρίς (ομάδα Β) ή με (ομάδα Γ) λεϊσμανίωση, με τη δοκιμή των Pearson’s χ2 ή Fisher’s exact (ποιοτικές μεταβλητές), με το two-sample t-test (ποσοτικές μεταβλητές με κανονική κατανομή) ή το Mann-Whitney U test (ποσοτικές μεταβλητές με μη κανονική κατανομή). Όλες οι μεταβλητές με τιμή P ≤ 0.25 στην αρχική διερευνητική δι-παραγοντική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν σε πολυπαραγοντικά μοντέλα λογιστικής ανάλυσης παλινδρόμησης. Στη συνέχεια, με τον ίδιο τρόπο διερευνήθηκε η επίδραση των νοσημάτων και παθολογικών καταστάσεων που συνυπήρχαν με τη λεϊσμανίωση στη συχνότητα, στην ένταση και ένταση των συμπτωμάτων, στη συχνότητα των εργαστηριακών διαταραχών και στις απόλυτες τιμές των εργαστηριακών παραμέτρων των σκύλων της ομάδας Γ.Στη μονοπαραγοντική ανάλυση, το μόνο από τα στοιχεία ταυτότητας των ζώων που διάφερε μεταξύ των ομάδων ήταν η φυλή, επειδή η πιθανότητα ενός σκύλου να είναι ακαθόριστης φυλής ήταν μεγαλύτερη μεταξύ των σκύλων με λεϊσμανίωση σε σύγκριση με τους σκύλους της ομάδας Β (P = 0,002). Αναφορικά με τις πληροφορίες από το ιστορικό, η πιθανότητα μη προληπτικής αγωγής για τα ενδοπαράσιτα, ανεπαρκούς προληπτικής αγωγής για τη διροφιλαρίωση και μη εφαρμογής εντομοαπωθητικών στους σκύλους ήταν μεγαλύτερη στην ομάδα Γ σε σύγκριση με τη Β (P = 0,003, P = 0,021 και P = 0,004, αντίστοιχα), ενώ το αντίθετο διαπιστώθηκε για τη χρήση εντομοκτόνων στο χώρο διαβίωσης (P < 0,001).Μεγάλος αριθμός νοσημάτων και παθολογικών καταστάσεων διαπιστώθηκε στους σκύλους και των τριών ομάδων. Η πιθανότητα θετικής ορολογικής εξέτασης για N. caninum και για Babesia spp. ήταν σημαντικά μεγαλύτερη μεταξύ των σκύλων της ομάδας Γ σε σύγκριση με εκείνους της ομάδας Β (P = 0,001 και P < 0,001, αντίστοιχα). Η πολυπαραγοντική ανάλυση δεν έδειξε κανένα παράγοντα κινδύνου για τη μόλυνση από L. infantum μεταξύ των στοιχείων ταυτότητας, των πληροφοριών από το ιστορικό και των νοσημάτων και παθολογικών καταστάσεων που συνυπήρχαν. Αντίθετα, η ακαθόριστη φυλή [P = 0,003; σχετικός λόγος πιθανοτήτων (ΣΛΠ): 11,2, 95% διάστημα εμπιστοσύνης (ΔΕ): 2,3-54,6], η μη χορήγηση προληπτικής αγωγής για τη διροφιλαρίωση (P = 0,011, ΣΛΠ: 26,5, 95% ΔΕ: 2,1-334,6), η οροθετικότητα για N. caninum (P = 0,001, ΣΛΠ: 17,1, 95% ΔΕ: 3,3-87,8), και η οροθετικότητα για Babesia spp. (P <0,001, ΣΛΠ: 37,6, 95% ΔΕ: 8,1-173,8), ήταν ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για τη διαπίστωση λεϊσμανίωσης μεταξύ των σκύλων που ήταν μολυσμένοι από L. infantum.Τέλος, οι σκύλοι με λεϊσμανίωση που ήταν ορολογικά θετικοί για N. caninum ήταν λιγότερο πιθανό να έχουν αυξημένη δραστηριότητα κρεατινικής κινάσης και είχαν μικρότερη δραστηριότητα του ενζύμου αυτού στον ορό του αίματος. Επιπλέον, οι σκύλοι με λεϊσμανίωση που ήταν ορολογικά θετικοί για Babesia spp. είχαν συχνότερα αυξημένες σφαιρίνες και λιγότερο συχνά μονοκυτταροπενία και υπασβεστιαιμία σε σύγκριση με τους ορολογικά αρνητικούς.