Μελέτη ενδογενούς εγκεφαλικής δραστηριότητας: ο ρόλος του GABAεργικού και χολινεργικού συστήματος στη φυσιολογία και παθολογία των νευρωνικών κυκλωμάτων του φλοιού

Abstract

Slow oscillations, the hallmark of non-REM sleep, and their cellular counterpart, Up and Down states, are considered a signature of cortical dynamics that reflect the intrinsic network organization. Although previous studies have explored the role of inhibition in regulating Up and Down state activity, little is known about whether this role changes with maturation. This is surprising since both slow oscillations and Up and Down states exhibit significant age-dependent alterations. Furthermore, despite the fact that cholinergic neuromodulation is a crucial regulator of cortical microcircuits’ properties and excitation-inhibition balance, the implication of cholinergic wiring in Up and Down states modulation is poorly studied. To elucidate the developmental impact of GABAb and GABAa receptors on Up and Down state activity, we conducted simultaneous extracellular and intracellular recordings ex vivo, in brain slices of young and adult male mice, using selective blockers, CGP and non-saturating concentration of gabazine, respectively. Blockade of both GABAb- and GABAa- signaling showed age-differentiated functions. CGP caused an increase in Down state duration in young animals, but a decrease in adults. Gabazine evoked Spike-and-Wave-Discharges in both ages; however, while young networks became completely epileptic, adults maintained the ability to generate Up and Down states. Furthermore, voltage clamp recordings of mIPSCs revealed that gabazine selectively blocks phasic currents, particularly involving postsynaptic mechanisms. The latter exhibit clear maturational changes, suggesting a different subunit composition of GABAa receptors between young and adult animals. Indeed, subsequent LFP recordings under diazepam (nanomolar or micromolar concentrations) revealed that mechanisms engaging the drug’s classical-binding-site, mediated by α1-subunit containing GABAa receptors, have a bigger contribution in Up state initiation in young networks compared to adults. In the continuum of our study, we strived to illuminate the role of α5-containing nicotinic acetylcholine receptors (α5* nAChRs) in the generation and maintenance mechanisms of Up and Down states. For this purpose we conducted simultaneous extracellular and intracellular recordings ex vivo in brain slices of young mice from two genotypes (wild type and a5-nACh receptor subunit knockout-ACNA5 Chrna5 or α5-/-) and observed a significant genotype dependent effect on Up and Down state activity: ACNA5 networks turned sluggish with alternating periods of shorter and less frequent Up states and longer Down states compared to wild type. To further elucidate the physiological properties of the ACNA5 microcircuit, we conducted voltage-clamp recordings from layer II/III pyramidal neurons. We showed that these cells receive significantly elevated levels of action-potential dependent inhibitory input which has possibly led to up regulation of synaptic GABAa receptor expression. Subsequent application of CGP and gabazine shed light on an interesting interplay only between α5-nACh receptors and GABAa receptors: blockade of synaptic fast inhibition did not affect ACNA5 networks which kept transiting in physiological Up and Down states, while wild type turned epileptic. Blockade of GABAb receptors had the same effects in the two genotypes, elongation of Up as well as Down states. Taken together, these findings help clarify the mechanisms that underlie the maturation of cortical network activity and enhance our understanding regarding the cortical circuits’ properties in the synchronized slow oscillatory state of the brain.

Οι Αργές Ταλαντώσεις, το χαρακτηριστικό ηλεκτροφυσιολογικό σήμα που καταγράφεται κατά τη non-REM φάση του ύπνου, και το ‘κυτταρικό τους αποτύπωμα’, τα Up-Down states, θεωρούνται η ταυτότητα των δικτύων του φλοιού και αντικατοπτρίζουν την ενδογενή λειτουργική συνδεσιμότητα του νεοφλοιού. Παρ’ όλο που προηγούμενες μελέτες έχουν ήδη ερευνήσει το ρόλο της αναστολής στη ρύθμιση της Up-Down state δραστηριότητας, λίγα δεδομένα υπάρχουν σχετικά με το αν και πώς αλλάζει ο ρόλος της κατά την ωρίμανση των δικτύων. Αυτό αποτελεί έκπληξη, καθώς οι Αργές Ταλαντώσεις όπως και τα Up-Down states, έχει δειχτεί πως υποβάλλονται σε αναπτυξιακές αλλαγές. Επιπροσθέτως, παρά το γεγονός ότι η χολινεργική νευροτροποποίηση είναι ένας πολύ σημαντικός ρυθμιστής των φλοιικών μικροδικτύων και της ισορροπίας διέγερσης-αναστολής, ο ρόλος του χολινεργικού στη ρύθμιση των Up-Down states δεν είναι καλά μελετημένος ακόμη. Για να ερευνήσουμε την επίδραση των αναπτυξιακών αλλαγών των GABAb και GABAa υποδοχέων στη ρύθμιση των Up-Down states, κάναμε ταυτόχρονες εξωκυττάριες και ενδοκυττάριες καταγραφές ex vivo σε φέτες από εγκέφαλο νεαρών και ενήλικων αρσενικών ποντικών, χρησιμοποιώντας επιλεκτικούς ανταγωνιστές των υποδοχέων, το CGP και χαμηλές συγκεντρώσεις gabazine, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα που πήραμε μετά το μπλοκάρισμα και των δύο υποδοχέων, διέφεραν ανάλογα με την ηλικία των πειραματοζώων. Το CGP προκάλεσε αύξηση των Down states στα νεαρά ποντίκια ενώ προκάλεσε μείωση στα ενήλικα. Η gabazine προκάλεσε την εμφάνιση επιληπτικών γεγονότων και στις δύο ηλικίες, παρ’ όλα αυτά ενώ τα νεαρά δίκτυα μετατράπηκαν πλήρως σε επιληπτικά με ελάχιστη ή καμία δυνατότητα να παράξουν φυσιολογική δραστηριότητα (Up-Down states), τα ενήλικα δίκτυα συνέχισαν να δίνουν φυσιολογική δραστηριότητα. Εν συνεχεία, καταγραφές μετασυναπτικών ανασταλτικών ρευμάτων (mIPSCs) με voltage-clamp, αποκάλυψαν ότι η συγκεκριμένη συγκέντρωση gabazine που χρησιμοποιήσαμε, μπλόκαρε επιλεκτικά τα φασικά ρεύματα και συγκεκριμένα τους μετασυναπτικούς μηχανισμούς. Καθώς η καταγραφή των mIPSCs ανέδειξε την ύπαρξη αναπτυξιακών διαφορών σε αυτά τα ρεύματα, οδηγηθήκαμε στην εξέταση της υπόθεσης της διαφορετικής σύστασης υπομονάδων των υποδοχέων. Οι εξωκυττάριες καταγραφές που κάναμε στη συνέχεια σε χαμηλές και υψηλές συγκεντρώσεις διαζεπάμης, αποκάλυψαν ότι η ‘κλασσική’ θέση πρόσδεσης του φαρμάκου στην α1-υπομονάδα διαφέρει στις δύο ηλικίες. Οι GABAa υποδοχείς που φέρουν α1-υπομονάδα παίζουν κρίσιμο ρόλο για την έναρξη της Up-Down state δραστηριότητας στα νεαρά δίκτυα, ενώ GABAa υποδοχείς με μη-α1-υπομονάδες παίζουν καθορίζουν τη δραστηριότητα στα ενήλικα. Στη συνέχεια της έρευνάς μας, θελήσαμε να διαλευκάνουμε το ρόλο των νικοτινικών υποδοχέων που φέρουν α5-υπομονάδα, όσον αφορά στους μηχανισμούς έναρξης, διατήρησης και τερματισμού της Up-Down state δραστηριότητας. Για αυτό το σκοπό, κάναμε ταυτόχρονες εξωκυττάριες και ενδοκυττάριες καταγραφές των Up-Down states ex vivo σε φέτες από εγκέφαλο αρσενικών νεαρών ποντικών -αγρίου τύπου και διαγονιδιακά (knock-out στις α5-υπομονάδες των νικοτινικών υποδοχέων, ACNA5) ποντίκια. Τα πειράματά μας έδειξαν ότι οι δύο γονότυποι παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές: τα δίκτυα των διαγονιδιακών ποντικών ήταν πιο ‘αργά’ με μικρά και αραιά Up states που παρεμβάλλονταν ανάμεσα σε μακρά Down states. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά των μικροδικτύων των ACNA5, κάναμε voltage clamp καταγραφές σε πυραμιδικούς νευρώνες της στιβάδας ΙΙ/ΙΙΙ: δείξαμε ότι τα κύτταρα αυτά δέχονται σημαντικά αυξημένες ποσότητες ανασταλτικών μετασυναπτικών ρευμάτων, με αποτέλεσμα να κάνουν αυξημένες εκφράσεις GABAa υποδοχέων. Επ’ ακόλουθα φαρμακολογικά πειράματα με τους ανταγωνιστές CGP και gabazine, έδειξαν μια ενδιαφέρουσα αλληλεπίδραση μεταξύ του χολινεργικού και GABAεργικού συστήματος στηρύθμιση αυτού ου μικροδικτύου: μπλοκάρισμα της φασικής αναστολής δεν επηρέασε τα ACNA5 δίκτυα, σε αντίθεση με τα αγρίου τύπου που μετατράπηκαν σε επιληπτικά. Η εφαρμογή του CGP είχε παρόμοια αποτελέσματα και στα δύο δίκτυα: επιμήκυνση των Up και Down states. Τα ευρήματά μας, βοηθούν σημαντικά στην κατανόηση της σημασίας των αναπτυξιακών αλλαγών που υφίστανται τα φλοιικά δίκτυα καθώς και των μηχανισμών που τα ρυθμίζουν.