Μελέτη του σηματοδοτικού μονοπατιού WNT στην καρκινογένεση

Abstract

INTRODUCTION: Wnt signaling pathway plays an important role in development and adult tissues homeostasis, through regulating many basic cellular processes. Deregulation of Wnt pathway has been observed in carcinogenesis and can be achieved by mutations, epigenetic modifications and expression level changes of Wnt pathway genes and also through crosstalk with other signaling pathways. Given Wnt pathway’s implication in colorectal cancer, as well as the development of new drugs targeting pathway components, the study of Wnt pathway is of high importance for the emergence of novel prognostic and potentially predictive biomarkers for targeted therapy against this pathway.MATERIALS & METHODS: One hundred two colorectal caner samples were included in the study. RNA extraction, reverse transcription and Real-Time PCR were sequentially conducted for the determination of WNT2, WNT3, WNT5A, WNT11, FZD4, FZD6, FZD7, GSK3B, CTNNB1 (β-catenin), TCF4, LEF1 and AXIN2 relative expression levels with 2-ΔΔCt method. Mutation analysis was performed in 55 DNA samples for KRAS, NRAS, BRAF genes of MAPK pathway, PIK3CA and AKT1 genes of PI3K/Akt pathway, CTNNB1 gene encoding β-catenin as well as the determination of MSI (microsatellite instability) status. In addition, methylation status of APC promoter was also studied in 38 samples. Furthermore, immunohistochemical analysis of β-catenin protein expression was conducted in 26 samples. Finally, statistical analysis of the results, investigation of linear correlations among the expression of Wnt genes and associations with clinicopathological features were carried out.RESULTS: Relative mRNA expression analysis showed increased levels of WNT2, WNT3, WNT5A, WNT11, FZD4, FZD6, FZD7, GSK3B, β-catenin, TCF4, LEF1, AXIN2 genes in 59%, 60%, 34%, 26%, 32%, 25%, 37%, 32%, 22%, 46%, 48%, 31% of cases, respectively, while decreased levels were detected in 20%, 24%, 29%, 49%, 34%, 33%, 29%, 37%, 57%, 31%, 38%, 39% of our samples, respectively. Statistically significant correlation emerged between elevated expression levels of WNT11 and T3-T4 tumours (p=0.037). Decreased mRNA expression levels of β-catenin were associated with N2 tumours (p=0.037). In addition, decreased GSK3B expression levels were preferentially observed in older patients (p=0.045) as well as T1-T2 tumours (p=0.010). Statistically significant correlations occurred between increased TCF4/LEF1 expression and T3-T4 category of the tumour (p=0.041 & p=0.027, respectively). Mutations in KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, AKT1, CTNNB1 genes along with presence of MSI were found in 36%, 2%, 11%, 11%, 0%, 2% and 7%, respectively. Statistically significant correlation was noted between increased expression levels of non-canonical WNT11 and mutated BRAF (p=0.033), while increased expression levels of non-canonical FZD6 were associated with absence of KRAS mutations (p=0.013). APC promoter methylation was displayed in 45% of our cases. Correlation of APC promoter methylation with male patients was determined (p=0.011), while absence of methylation was preferentially observed in decreased FZD6 and β-catenin expression levels (p=0.027 & p=0.054, respectively). Immunohistochemical analysis of β-catenin showed reduced membranous expression in 77% of cases, increased cytoplasmic expression in 73% of cases and positive nuclear staining in 77% of cases. Increased membranous β-catenin expression was associated with stage I-II, though marginally (p=0.053). Membranous/cytoplasmic protein levels of β-catenin were positively correlated with its mRNA expression (p=0.039 & p=0.046, respectively), while cytoplasmic levels were marginally correlated with ΑΧΙΝ2 mRNA expression (p=0.053). Multiple statistically significant positive linear correlations were detected among the expression of the investigated Wnt genes. The number of canonical Wnt genes displaying concurrent elevated/decreased expression was related with the expression of Wnt target-gene, AXIN2 (p<0.001 in both cases). In addition, increased mRNA expression in at least 1 or more canonical genes was associated with stage I-II (p=0.046).DISCUSSION - CONCLUSION: •Deregulation of Wnt pathway genes’ expression was frequently observed in our cohort. •The expression of WNT11, β-catenin, GSK3B, TCF4 and LEF1 genes could possibly serve as biomarkers of tumour biological behavior. •Wnt-MAPK pathway crosstalk was indicated from the correlations emerged between the non-canonical WNT11/FZD6 genes’ expression and mutations detected in BRAF/KRAS genes, respectively. •Aberrant Wnt pathway activation was reflected in β-catenin protein expression as increased levels were found in cytoplasm, decreased in membrane with positive nuclear staining in the majority of cases.•The high importance of β-catenin mRNA expression levels in colorectal cancer was underlined through the correlation of mRNA expression with protein expression as well as N category of tumour. •Multilevel deregulation of the pathway was depicted with coexpression patterns observed in a high frequency of our samples, as suggested by the multiple statistically significant linear correlations observed among the investigated Wnt genes.•Concurrent elevated levels of Wnt genes potentially enhance Wnt transcriptional activity and signaling, as the number of coexpressed genes was correlated with the expression of Wnt target-gene AXIN2.•Canonical Wnt pathway gene coexpression occurs early in carcinogenesis and it is likely a good prognostic biomarker, since increased expression of at least 1 or more canonical genes was associated with stage I-II tumour.•The aforementioned findings highlight the significance of Wnt signaling pathway in colorectal carcinogenesis and emerge as factors for patient stratification regarding future targeted therapy against Wnt components.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και στην ομοιόσταση ενηλίκων ιστών, ρυθμίζοντας βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt έχει παρατηρηθεί στην καρκινογένεση και επέρχεται μέσω μεταλλαγών, επιγενετικών τροποποιήσεων και μεταβολών της έκφρασης γονιδίων του μονοπατιού καθώς και μέσω αλληλεπίδρασης με διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια. Δεδομένης της συμμετοχής του μονοπατιού στον καρκίνο παχέος εντέρου, καθώς και της ανάπτυξης φαρμάκων που στοχεύουν σε αυτό, η μελέτη του αποκτά ιδιαίτερη σημασία τόσο για την ανάδειξη προγνωστικών όσο και δυνητικά προβλεπτικών βιοδεικτών για τις στοχευμένες θεραπείες. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Αναλύθηκαν 102 δείγματα καρκίνου παχέος εντέρου. Πραγματοποιήθηκε απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή και Real-Time PCR για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων WNT2, WNT3, WNT5A, WNT11, FZD4, FZD6, FZD7, GSK3B, CTNNB1 (β-κατενίνη), TCF4, LEF1 και AXIN2 με την μέθοδο 2-ΔΔCt. Σε 55 δείγματα DNA πραγματοποιήθηκε έλεγχος για την παρουσία μεταλλαγών στα γονίδια KRAS, NRAS, BRAF του μονοπατιού MAPK, στα γονίδια PIK3CA, AKT1 του μονοπατιού PI3K/Akt, στο γονίδιο της β-κατενίνης (CTNNB1) καθώς και για την παρουσία μικροδορυφορικής αστάθειας (MSI). Επιπλέον, διενεργήθηκε έλεγχος της μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου APC σε 38 δείγματα. Ελέγχθηκε ακόμα η έκφραση της β-κατενίνης σε επίπεδο πρωτεΐνης με την χρήση ανοσοϊστοχημείας σε 26 δείγματα. Ακολούθησε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, αναζήτηση γραμμικών συσχετίσεων της έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων και συσχετίσεις με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η ανάλυση των σχετικών επιπέδων έκφρασης κατέδειξε αυξημένα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων WNT2, WNT3, WNT5A, WNT11, FZD4, FZD6, FZD7, GSK3B, β-κατενίνης, TCF4, LEF1, AXIN2 σε ποσοστό 59%, 60%, 34%, 26%, 32%, 25%, 37%, 32%, 22%, 46%, 48%, 31%, αντίστοιχα, ενώ μειωμένα επίπεδα έκφρασης καταγράφηκαν στο 20%, 24%, 29%, 49%, 34%, 33%, 29%, 37%, 57%, 31%, 38%, 39% των δειγμάτων, αντίστοιχα. Καταγράφηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των αυξημένων επιπέδων έκφρασης του WNT11 με τους όγκους κατηγορίας Τ3-Τ4 (p=0.037). Ακόμα, η μειωμένη mRNA έκφραση της β-κατενίνης συσχετίστηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό με τους όγκους κατηγορίας Ν2 (p=0.037). Επιπλέον, τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης της GSK3B συσχετίστηκαν με την μεγαλύτερη ηλικία των ασθενών (p=0.045) καθώς και με την κατηγορία T1-T2 των όγκων (p=0.010). Σημειώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της αυξημένης έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων TCF4 και LEF1 με την κατηγορία Τ3-Τ4 των όγκων (p=0.041 & p=0.027, αντίστοιχα). Μεταλλαγές στα γονίδια KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, AKT1, CTNNB1 καθώς και παρουσία MSI παρατηρήθηκαν σε ποσοστό 36%, 2%, 11%, 11%, 0%, 2% και 7%, αντίστοιχα. Καταγράφηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των αυξημένων επιπέδων έκφρασης του μη-κανονικού συνδέτη WNT11 με την παρουσία μεταλλαγών στο γονίδιο BRAF (p=0.033), καθώς και των αυξημένων επιπέδων έκφρασης του μη-κανονικού υποδοχέα FZD6 με την απουσία μεταλλαγών στο γονίδιο KRAS (p=0.013). Μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου APC παρατηρήθηκε στο 45% των δειγμάτων. Προέκυψε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της μεθυλίωσης με τους άνδρες ασθενείς (p=0.011) και της απουσίας μεθυλίωσης με τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων FZD6 και β-κατενίνης (p=0.027 & p=0.054, αντίστοιχα). Η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της έκφρασης της β-κατενίνης κατέδειξε μειωμένη έκφραση μεμβρανικής β-κατενίνης στο 77% των περιπτώσεων, αυξημένη κυτταροπλασματική έκφραση στο 73% των περιπτώσεων, καθώς και θετική πυρηνική έκφραση στο 77% των δειγμάτων. Οριακά στατιστικά σημαντική συσχέτιση προέκυψε μεταξύ της αυξημένης μεμβρανικής έκφρασης με το στάδιο I-II (p=0.053). Στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση προέκυψε μεταξύ των μεμβρανικών/κυτταροπλασματικών επιπέδων έκφρασης με την mRNA έκφρασή της (p=0.039 & p=0.046, αντίστοιχα). Ακόμα, παρατηρήθηκε οριακά στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των κυτταροπλασματικών επιπέδων της β-κατενίνης και της έκφρασης της AXIN2 (p=0.053). Πολλαπλές στατιστικά σημαντικές θετικές γραμμικές συσχετίσεις καταγράφηκαν μεταξύ της έκφρασης των γονιδίων Wnt. Ο αριθμός των γονιδίων του κανονικού μονοπατιού Wnt που εμφανίζουν ταυτόχρονα αυξημένη ή μειωμένη έκφραση συσχετίστηκε θετικά ή αρνητικά, αντίστοιχα, με την έκφραση του γονιδίου-στόχου AXIN2 (p<0.001 και στις 2 περιπτώσεις). Επιπλέον, σημειώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της αυξημένης έκφρασης σε 1 ή περισσότερα γονίδια του κανονικού μονοπατιού με το στάδιο I-II (p=0.046). ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: •Συμπερασματικά, παρατηρήθηκε σημαντική απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt στον καρκίνο παχέος εντέρου. •Μεταβολή των επιπέδων έκφρασης γονιδίων του μονοπατιού Wnt καταγράφηκε σε σημαντικό ποσοστό των δειγμάτων.•Η έκφραση των γονιδίων WNT11, β-κατενίνης, GSK3B, TCF4 και LEF1 αποτελεί πιθανό δείκτη βιολογικής συμπεριφοράς των όγκων παχέος εντέρου. •Η αλληλεπίδραση των μονοπατιών Wnt-MAPK στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου υποστηρίζεται από τις συσχετίσεις των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του μη-κανονικού μονοπατιού WNT11 και FZD6 με την παρουσία μεταλλαγών στα γονίδια BRAF και KRAS, αντίστοιχα. •Η απορρύθμιση σηματοδότησης Wnt αποτυπώθηκε και στην πρωτεϊνική έκφραση της β-κατενίνης, η οποία παρουσιάστηκε αυξημένη στο κυτταρόπλασμα, μειωμένη στην μεμβράνη και με θετική έκφραση στον πυρήνα στην πλειονότητα των περιπτώσεων.•Η σημαντικότητα της έκφρασης mRNA της β-κατενίνης στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου υπογραμμίζεται από την συσχέτιση της mRNA έκφρασής της τόσο με την πρωτεϊνική της έκφραση όσο και με την κατηγορία Ν του όγκου.•Απεικονίστηκε μια πολυεπίπεδη απορρύθμιση του μονοπατιού, όπως υποδεικνύεται από τις πολλαπλές στατιστικά σημαντικές θετικές γραμμικές συσχετίσεις που σημειώθηκαν μεταξύ των γονιδίων Wnt, με ταυτόχρονη αυξημένη/μειωμένη έκφραση να παρατηρείται σε υψηλό ποσοστό των δειγμάτων•Η ταυτόχρονη αυξημένη έκφραση των γονιδίων του κανονικού μονοπατιού Wnt πιθανά ενισχύει την μεταγραφή γονιδίων-στόχων του μονοπατιού και κατ’ επέκταση την σηματοδότηση Wnt, όπως προέκυψε από την συσχέτιση του αριθμού των γονιδίων του κανονικού μονοπατιού Wnt που εμφανίζουν ταυτόχρονα αυξημένη έκφραση με την αυξημένη έκφραση του γονιδίου-στόχου AXIN2.•Η αυξημένη έκφραση των γονιδίων του κανονικού μονοπατιού Wnt (ενός ή περισσοτέρων ταυτόχρονα) φαίνεται ότι αποτελεί πρώιμο γεγονός στην καρκινογένεση και ένα πιθανό δείκτη καλής πρόγνωσης, καθώς συσχετίσθηκε με το στάδιο I-II του όγκου.•Τα παραπάνω ευρήματα τονίζουν την σημασία της μελέτης του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου και αναδεικνύουν την πιθανή σημασία της διερεύνησης των επιπέδων έκφρασης ως προς την επιλογή ασθενών για την χορήγηση στοχεύουσας θεραπείας έναντι του μονοπατιού Wnt.