Neurotoxicity and immunotoxicity of pesticides

Abstract

The aims of the present in vitro study were to evaluate the capacity of two widely used pesticides, diazinon-oxon (DZO) and fipronil (FIP), to cause neurotoxicity in mouse N2a neuroblastoma and rat C6 glioma cells and immunotoxicity in human lymphocytic Jurkat and human promyelotic THP-1 cells. Sub-lethal concentrations of DZO and FIP, established by cell viability assays, were used in all experiments to study the mechanisms underlying their possible toxicity. Western blotting analysis revealed that the inhibition of axon-like processes in N2a neuronal cells and inhibition of outgrowth extensions in C6 glioma cells was present only in cells treated with DZO. This was associated with modifications of a variety of cytoskeletal proteins, which play a major role in cell development, growth and maintenance. Densitometric scanning of C6 cell extracts demonstrated that exposure to DZO decreased glial fibrillary acidic protein (GFAP) and tubulin and microtubule associated protein (MAP1B). Densitometric scanning of Western blots of lysates of N2a neurobla-stoma cells revealed that exposure to DZO increased the expression of phosphorylated neurofilament heavy chain (pNFH) and heat shock protein-70 (HSP70), and reduced growth-associated protein-4 (GAP-43). On the other hand, FIP caused severe disruption of the developmentally important ERK 1/2-MAP kinase pathway, characterized by major reductions in MAPK kinase, mainly ERK 1/2, without significant changes in total or phosphorylated NFH. The present study also examined the possible immunotoxic effects of DZO and FIP by interfering with the production of some important cytokines. The study investigated the effects of exposure to DZO and FIP on cytokine levels, gene transcription, and expression of some cell signalling pathways in human lymphocytic Jurkat and human promyelotic THP-1 cells. Jurkat cells exposed to 10 μM DZO significantly enhanced IFN-γ mRNA expression and increased NF-kB protein levels. The MAPK signalling pathway also appears to be affected by DZO in Jurkat cells, as pERK1, tERK1 and tERK2 protein levels were decreased. Significant up-regulation of TNF-α mRNA was observed in THP-1 cells exposed to 1 μM or 5 μM DZO for 6 h and exposure of THP-1 cells to DZO (5 μM) also up-regulated IL-1β mRNA and caused a slight increase in cytokine production. Exposure to DZO caused significant reductions of pERK2 (10 μM) and tERK2 (5 μM) indicating that the MAPK pathway was involved. The present study demonstrated for the first time that FIP has inhibitory effects on the production of IL-2 by Jurkat cells, which was also characterized by downregulation of IL-2 mRNA and by interference with the MAPK pathway. In addition, exposure to FIP caused reduced IFN-γ secretion in Jurkat cells and reduced IL-1β cytokine release and IL-1β mRNA expression in THP-1 cells

Sidiropoulou E, Διδακτορική διατριβή (Doctor in Philosophy): Neurotoxicity and immunotoxicity of pesticides, Faculty of Health and Life Sciences, School of Veterinary Science, University of Liverpool (2014). Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση των βιοχημικών φαινομένων και μηχανισμών τοξικότητας δύο ευρείας χρήσης εξωπαρασιτοκτόνων παγκοσμίως, του fipronil, και του μεταβολίτη του diazinon, diazinon-oxon, στο νευρικό και ανοσοποιητικό σύστημα. Τα παρασιτοκτόνα αυτά έχουν την δυνατότητα να προκαλέσουν τοξικώσεις σε ζώα αλλά και στον άνθρωπο.Όσον αφορά το νευρικό σύστημα, χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές από επίμυ (C6 γλοιωματικά κύτταρα), ποντικό (N2α-νευροβλαστωματικά). Αρχικά, εφαρμόστηκε η φασματοφωτομετρική μέθοδος αναγωγής της ουσίας MTT (cell viability assays) για να προσδιορίσουμε συγκεντρώσεις των παρασιτοκτόνων που δεν προκαλούν κυτταρικό θάνατο (1, 5 και 10μΜ). Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε η ανοσοχημική μέθοδος κατά Western (Western blotting analysis) όπου με τη χρήση αντισωμάτων προσδιορίστηκαν τα επίπεδα πρωτεινών που σχετίζονται με την δυναμική του κυτταρικού σκελετού. Περαιτέρω, μελετήθηκε η επίδραση των δύο αυτών ουσιών στον σχηματισμό νευραξονικών προεκβολών (rat C6 glioma cells) ή νευραξόνων (mouse N2a-neuroblastoma cells)(inhibition of axon-like processes), που προσδιορίστηκε ποσοτικά με το μικροσκόπιο. Τέλος, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ακετυλοχολινεστεράσης -ενός σημαντικού ενζύμου για την λειτουργία του νευρικού συστήματος-, σε όλες τις υπό διερεύνηση συγκεντρώσεις των ουσιών αυτών.Πιο συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η επίδραση του βασικού μεταβολίτη του εξωπαρασιτοκτόνου diazinon, diazinon-oxon (DZO), σε νευροβλαστωματικά κύτταρα N2a ποντικού, υπό διαφοροποίηση. Σε συγκεντρώσεις που δεν επηρεάζουν την βιωσιμότητά τους βρέθηκε ότι προκαλείται αναστολή του νευροαξονικών προεκβολών τους μετά από 24 ώρες έκθεση. Εφαρμόζοντας την μέθοδο Western Blotting analysis, προσδιορίστηκε η πυκνότητα πρωτεινών όπως της βαριάς αλύσου (NF-H) των νευρικών νηματίων και βρέθηκε αύξηση της φωσφορυλίωσης τους μόνο στις δύο υψηλότερες δόσεις, συγκριτικά με κύτταρα μάρτυρες. Σε αντίθεση, η πρωτείνη ανάπτυξης του νευράξονα-43 (GAP-43) παρουσίασε σημαντική μείωση σε όλες τις συγκεντρώσεις. Η νευροτοξική δράση αυτή του DZO βρέθηκε οτι δεν σχετίζεται με παράλληλη αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE).Περαιτέρω, ερευνήθηκε η επίδραση του μεταβολίτη DZO σε κυτταροσκελετικές πρωτείνες οπως η σωληνίνη, η GFAP (glial fibrillary acidic protein) και η κυτταροσκελετική πρωτείνη MAP1B που σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους σε υπό διαφοροποίηση γλοιωματικά κύτταρα C6 επίμυος. Η κατά Western ανάλυση έδειξε μείωση των πρωτεινών αυτών στη μεγαλύτερη συγκέντρωση του, ενώ η πρωτείνη GFAP βρέθηκε μειωμένη σε όλες τις συγκεντρώσεις. Αξιοσημείωτο είναι ότι το DZO προκαλεί αναστολή των προεκβολών των C6 κυττάρων.Παρόμοια, το FIP προκάλεσε σημαντική αναστολή των νευροαξονικών προεκβολών στα N2a κύτταρα χωρίς πάλι να επηρεάζει την βιωσιμότητά τους. Επίσης, επηρέασε σημαντικά την οδό κυτταρικής σηματοδότησης της ERK1/2-MAP κινάσης που παίζει ρόλο στην διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων αλλά και μείωσε τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων μορφών των ERK1/2 και MEK1/2. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι και το FIP ασκεί τοξική δράση στο νευρικό σύστημα.