Ecological studies on Paecilomyces lilacinus strain 251 and their importance for biocontrol of plant-parasitic nematodes and environmental risk assessment

Abstract

The present study was conducted to investigate the factors affecting the fate and behaviour of the nematophagous biocontrol fungus P. lilacinus strain 251 (PL251) after application to soil and evaluate its interactions with plants, nematodes and other components of the soil ecosystem. Studies on the persistence showed the low persistence of the fungal antagonist after applying PL251 to different soil substrates. The fungus was never found to proliferate, but declined in soil over time. This indicates that repeated applications are necessary to achieve sufficient, long-term biocontrol. Temperature and substrate type were identified as factors affecting the survival of PL251 in soil. In contrast, PL251 persistence was not affected by application rate and the presence of the target nematodes or the host plant. Paecilomyces lilacinus strain 251 did not colonize endophytically the roots of a wide range of plant species tested. However, for the first time, PL251 was isolated in significant numbers from healthy root tissue of barley plants. In soil column assays, investigations on the vertical movement of PL251 revealed that fungal conidia generally remained within the upper 10 cm of the soil substrates tested. This indicates that the percolation potential of the PL251 conidia is low. Incorporating the applied conidia into the upper soil layer resulted in some movement, helping to better distribute the biocontrol fungus within the rooting zone.Investigations on the interactions between PL251 and other antagonists showed no adverse effects on the survival and virulence of entomopathogenic nematodes when co-applied to soil. Furthermore, PL251 did not affect the mycorrhization of tomato roots. In-vitro tests also revealed that in dual cultures, the growth rates of other biocontrol fungi were not affected by PL251.Finally, the potential of the protoplast-mediated transformation technique to obtain PL251 transformants carrying the benomyl-resistance gene and either the GFP- or DsRed-gene was investigated. Co-transformation of PL251 with the fluorescent markers was not observed, but benomyl resistant transformants, able to grow on medium amended with up to 30 mg ml-1 benomyl are now available for further ecological studies.

Στο πλαίσιο της διδακτορικής μου διατριβής μελετήθηκαν οι παράγοντες που επηρεάζουν τη συμπεριφορά του νηματωδοφάγου μύκητα Paecilomyces lilacinus στέλεχος 251 (PL251) μετά την εφαρμογή του στο έδαφος, οι αλληλεπιδράσεις του βιολογικού αυτού παράγοντα με τα φυτά, τους νηματώδεις και άλλα συστατικά του εδαφικού οικοσυστήματος καθώς και η σημασία αυτών για την βιολογική καταπολέμηση των φυτοπαρασιτικών νηματωδών. Η μελέτη υπολειμματικότητας φανέρωσε την χαμηλή υπολειμματικότητα του μύκητα σε διάφορα εδαφικά υποστρώματα. Η συγκέντρωση του μύκητα στο έδαφος συνεχώς μειωνόταν με το χρόνο, κάνοντας απαραίτητες τις πολλαπλές εφαρμογές σε μια καλλιεργητική περίοδο προκειμένου να υπάρξει ικανοποιητικός έλεγχος των φυτοπαρασιτικών νηματωδών. Η επιβίωση του μύκητα στο έδαφος επηρεάστηκε από την θερμοκρασία και τον τύπο του εδάφους, ενώ δεν επηρεάστηκε από τον δόση εφαρμογής και την παρουσία των νηματωδών και του φυτού στο έδαφος. Ο μύκητας P. lilacinus βρέθηκε να αποικεί ενδοφυτικά τις ρίζες αρκετών φυτικών ειδών από αυτά που εξετάστηκαν. Επιπρόσθετα, σε στήλες εδάφους μελετήθηκε η κάθετη κίνηση των σπορίων του μύκητα σε διαφορετικά εδαφικά υποστρώματα. Η κάθετη κίνηση του μύκητα ήταν περιορισμένη, με την πλειονότητα των σπορίων να παραμένουν στα πρώτα 10 εκατοστά του υποστρώματος. Δεν εντοπίστηκε κάποια αρνητική επίδραση του μύκητα στους εντομοπαθογόνους νηματώδεις και στις μυκόρριζες, μετά από ταυτόχρονη εφαρμογή τους στο έδαφος. Τέλος, επιχειρήθηκε ο γενετικός μετασχηματισμός του βιολογικού αυτού παράγοντα με το gfp-(green fluorescent protein) γονίδιο, που κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη με τη μέθοδο του Αγροβακτηρίου (Agrobacterium-mediated transformation).

Untersuchungen zur Ökologie von Paecilomyces lilacinus Stamm 251 und die Bedeutung für die biologische Kontrolle pflanzenparasitärer Nematoden sowie die Abschätzung von Risiken für die Umwelt. Zur Untersuchung der Interaktionen des fakultativen, eipathogenen Pilzes Paecilomyces lilacinus Stamm 251 (PL251) mit Pflanzen, Nematoden und antagonistischen Bodenpilzen wurden Versuche zur Persistenz und möglichen Etablierung in einem Ökosystem durchgeführt. Es konnte unter verschiedenen Bedingungen demonstriert werden, dass PL251 nur eine geringe Persistenz zeigte. Die Untersuchung der Populationsdichte von PL251 nach einer Bodenapplikation konnte zeigen, dass sich der Pilz im Boden nicht vermehrt. Im Gegensatz dazu wurde eine signifikante Abnahme über die Zeit festgestellt. Dies lässt vermuten, dass eine mehrmalige Applikation des Antagonisten notwendig ist, um eine ausreichende und nachhaltige Bekämpfung der pflanzenparasitären Nematoden sicherzustellen. Temperatur und die Zusammensetzung des Substrates beeinflussten signifikant die Persistenz von PL251. Die Ausgangskonzentration im Boden sowie die Anwesenheit von Nematoden und/oder der Wirtspflanze spielten keine Rolle bei der Überdauerung des Pilzes im Boden. Grundsätzlich war PL251 nicht in der Lage verschiedene Pflanzen endophytisch zu besiedeln. Es konnte jedoch zu ersten mal PL251 in hohen Dichten aus Wurzeln von Gerstenpflanzen reisoliert werden. Des Weiteren wurde die Verteilung der Konidien von PL251 im Boden in Abhängigkeit von verschiedenen Niederschlagsmengen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Konidien über die obersten 10 cm des Bodens nicht verlagert wurden. Eine Einarbeitung der applizierten Konidien in die oberste Bodenschicht führte allerdings zu einer besseren Verteilung innerhalb der obersten 20 cm. Untersuchungen zur Interaktion von PL251 mit verschiedenen Antagonisten zeigten keine negativen Auswirkung nach der Anwendung von PL251. Die Wirkung und Persistenz von entomopathogenen Nematoden, die Mycorrhizierung von Tomatenpflanzen, sowie die Wachstumsrate von pilzlichen Antagonisten blieben unbeinflusst nach der Applikation von PL251. Weiterhin wurde mit Hilfe der Protoplasten-Transformation versucht PL251 mit einer Benomyl-Resistenz, gekoppelt mit den Fluoreszenz Markern GFP- oder DsRed, zu versehen. Die Ko-Transformation von PL251 mit einem Fluoreszenz Marker wurde nicht erreicht, jedoch stehen nun Isolate mit einer Benomyl-Resistenz zur Verfügung, die für weitergehende Studien verwendet werden können.